施婷婷，楊秀蓮，王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)源抑制物質(zhì)分析

施婷婷，楊秀蓮，王良桂

(南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

以‘紫梗籽銀’桂(Osmanthusfragrans′Zigengziyin′)種子為試材，對(duì)其內(nèi)果皮、種實(shí)內(nèi)源抑制物質(zhì)進(jìn)行提取、生物測定，并采用GC-MS進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：①‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮、種實(shí)均含有抑制種子萌發(fā)和幼苗生長的物質(zhì)，且內(nèi)果皮、種實(shí)中各分離相的抑制效果均不相同。其中石油醚相抑制作用最弱，乙酸乙酯相和甲醇相抑制作用較強(qiáng)。②GC-MS 鑒定結(jié)果顯示，‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮、種實(shí)中存在多種抑制物質(zhì)，包括棕櫚酸、油酸、9，12-十八碳二烯酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)，主要為脂肪酸類物質(zhì)。

‘紫梗籽銀’桂；種子；內(nèi)源抑制物質(zhì)；發(fā)芽率；幼苗生長；GC-MS

許多植物的種子都存在休眠現(xiàn)象，而種子的休眠原因也是多種多樣的，主要包括了種皮的吸水障礙、種胚的休眠以及種子中存在萌發(fā)抑制類物質(zhì)等原因，其中由種子萌發(fā)抑制物引起的休眠是最常見的種子休眠類型之一。植物種子的內(nèi)源抑制物質(zhì)種類非常多，除脫落酸(ABA)外，還包括了有機(jī)酸、酚類、醛類、不飽和內(nèi)酯類，以及一些氣體類物質(zhì)，如氫氰酸、乙烯、芥子油、氨等[1]。目前，關(guān)于植物種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的研究已取得了很大進(jìn)展，如青錢柳(Cyclocaryapaliurus)[2]、四川牡丹(Paeoniadecomposita)[3]、秦艽(Gentianamacrophylla)[4]等。而關(guān)于桂花種子內(nèi)源抑制物質(zhì)的研究少有研究報(bào)道。

‘紫梗籽銀’桂是桂花銀桂品種群中的一個(gè)品種，其花香氣清幽淡雅，且每年可開花2～3次，深受人們的喜愛。同時(shí)，‘紫梗籽銀’桂花后結(jié)實(shí)率高，果實(shí)豐滿，性狀穩(wěn)定，是我國重要的園林綠化樹種。然而其種子具有明顯的休眠習(xí)性，這給‘紫梗籽銀’桂的苗木生產(chǎn)帶來了很多不便。楊秀蓮等[5]曾初步探討了‘紫梗籽銀’桂種子的休眠原因，發(fā)現(xiàn)‘紫梗籽銀’桂種子堅(jiān)硬的外種皮不是引起休眠的原因，推測種子的休眠是由種子中所含的抑制物質(zhì)引起。故本研究以‘紫梗籽銀’桂為材料，從抑制種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物質(zhì)入手，分別比較不同有機(jī)溶劑相中抑制物質(zhì)的作用，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)對(duì)抑制物質(zhì)成分進(jìn)行初步分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2007年5月底，于南京林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)采集完全成熟的‘紫梗籽銀’桂種子；于南京市蔬菜種子公司購買綠優(yōu)1號(hào)白菜種子(白菜種子純度95%，凈度98%，發(fā)芽率85%以上)。

1.2 種子不同部位內(nèi)源抑制物質(zhì)的提取

取‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮和種實(shí)各10 g置于250 mL容量瓶中，用80%的甲醇溶液200 mL，于1～4 ℃的恒溫條件下密閉浸提48 h，然后將所得濾液在35 ℃下減壓濃縮后定容至1 g·mL-1(以每mL濃縮液中含有原材料的量計(jì)算)，最后置于1～4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 種子不同部位內(nèi)源抑制物質(zhì)的初步分離

參照黃耀閣等[6]系統(tǒng)溶劑法，將‘紫梗籽銀’桂種子不同部位內(nèi)源抑制物質(zhì)的粗提液分為石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相。即將‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)2部分烘干(35 ℃)，分別取磨碎后過1 mm篩的粉末各15 g，各加入5倍體積的80%甲醇，在1～5 ℃的恒溫條件下密閉浸提，24 h后過濾，重復(fù)浸提3次，混合3次所得的浸提液，再加入等量石油醚，相同條件下萃取3次，得到石油醚相和水相；然后在水相浸提液加入等量乙醚，相同條件下萃取3次，得到乙醚相和水相；再在水相浸提液中加入等量乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相與水相；再將水相浸提液在65 ℃減壓蒸干，除去水分得到干物質(zhì)后，用甲醇溶解過濾，得到甲醇相和水相。最后將各有機(jī)相溶液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器ZFQ85B上進(jìn)行濃縮蒸發(fā)，定容至10 mL，置于1～4 ℃冰箱中備用。

1.4 種子不同部位內(nèi)源抑制物質(zhì)各分離物活性的生物測定

將上述所得各分離相(0.2 g·mL-1)和稀釋1倍后的各有機(jī)相溶液(0.1 g·mL-1)進(jìn)行生物測定。在直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)分別加入‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮和種實(shí)各分離相的提取液3 mL，白菜籽50粒，待各分離相有機(jī)溶劑完全揮發(fā)(水相除外)后，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)再加入蒸餾水3 mL，并以同體積蒸餾水作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。置于25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，進(jìn)行白菜籽發(fā)芽試驗(yàn)，每天記錄發(fā)芽數(shù)，48 h后統(tǒng)計(jì)白菜籽的發(fā)芽率(以露出胚根為發(fā)芽的標(biāo)準(zhǔn))，72 h后測其苗高和根長。

1.5 GC-MS鑒定方法

對(duì)‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮和種實(shí)甲醇浸提液進(jìn)行GC-MS鑒定，測定在中國林業(yè)科學(xué)院林產(chǎn)化學(xué)研究所分析測試中心質(zhì)譜室進(jìn)行鑒定。參照韓寶瑞等[7]鑒定方法：儀器型號(hào)為美國Agelient 6890N/5973N GC-MS(氣譜-質(zhì)譜)聯(lián)用儀；氣譜條件：HP-5MS柱，30 m×0.32 mm×0.25 um；升溫程序100～250 ℃(10 min)；程序升溫10 ℃·min-1；進(jìn)樣1 uL；分流比100∶1；載氣為氦氣；汽化室溫度：260 ℃。質(zhì)譜條件：離子源EI；源溫230 ℃；電離電壓 70 eV。由計(jì)算機(jī)控制的庫存信號(hào)檢查各個(gè)成分的質(zhì)譜圖并與標(biāo)準(zhǔn)庫譜圖核對(duì)，以面積歸一化法計(jì)算出各成分的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)果皮和種實(shí)中各分離相對(duì)白菜種子發(fā)芽率和幼苗生長的影響

2.1.1 內(nèi)果皮和種實(shí)中各分離相對(duì)白菜種子發(fā)芽率的影響 由圖1可見，除石油醚相外，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)的乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相以及水相均對(duì)白菜籽的發(fā)芽有抑制作用，且方差分析結(jié)果表明，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)內(nèi)源抑制物質(zhì)浸提液中除石油醚相對(duì)白菜籽發(fā)芽率的影響不顯著外，其他各相與對(duì)照相比均達(dá)到極顯著差異。內(nèi)果皮各分離相浸提液中乙酸乙酯相的抑制作用最強(qiáng)，浸提液0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1抑制率分別達(dá)到90.6%、94.8%；而以乙醚相浸提液的抑制活性最弱，僅為8.3%、21.67%；石油醚相對(duì)白菜籽發(fā)芽基本沒有抑制作用，浸提液0.1 g·mL-1處理的白菜籽發(fā)芽率比對(duì)照降低了3.15%，浸提液0.2 g·mL-1處理的白菜籽發(fā)芽率比對(duì)照提高了2.08%。相比內(nèi)果皮，種實(shí)各分離相浸提液對(duì)白菜籽的發(fā)芽抑制作用更大，種實(shí)各分離相浸提液中也是乙酸乙酯相的抑制作用最強(qiáng)，浸提液0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1的抑制率分別達(dá)到92.7%、95.8%；以水相浸提液的抑制活性最弱，僅為20.8%、28.1%；石油醚相對(duì)白菜籽發(fā)芽基本沒有抑制作用，其浸提液0.1 g·mL-1處理的白菜籽發(fā)芽率比對(duì)照降低了6.25%，而浸提液0.2 g·mL-1處理的白菜籽發(fā)芽率比對(duì)照提高了2.08%。據(jù)此初步證實(shí)‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)均含有內(nèi)源抑制物質(zhì)，而且不同部位提取的不同有機(jī)相對(duì)白菜籽發(fā)芽率的抑制程度各有不同，種實(shí)各分離相對(duì)白菜籽發(fā)芽率的抑制作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂宜嵋阴ハ?甲醇相>乙醚相>水相>石油醚相，而內(nèi)果皮各分離相對(duì)白菜籽發(fā)芽率的抑制作用的強(qiáng)弱順序則為：乙酸乙酯相>甲醇相>水相>乙醚相>石油醚相。

圖1 ‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)中抑制物對(duì)白菜發(fā)芽率的影響

圖1結(jié)果表明：‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)浸提液的發(fā)芽測定結(jié)果大致相同，但各有機(jī)相對(duì)白菜籽發(fā)芽的抑制作用不同?！瞎Ｗ雁y’桂內(nèi)果皮和種實(shí)中的抑制物質(zhì)均主要集中在乙酸乙酯相和甲醇相中，對(duì)白菜種子發(fā)芽起到明顯抑制作用；而其石油醚相均與對(duì)照無差異，說明石油醚相中也許不存在抑制物質(zhì)。

2.1.2 內(nèi)果皮和種實(shí)中各分離相對(duì)白菜籽幼苗生長的影響 從圖2可以看出，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)各分離相對(duì)白菜籽幼苗生長的抑制作用差異達(dá)到極顯著水平。‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮、種實(shí)各相對(duì)白菜籽苗高抑制作用的強(qiáng)弱順序?yàn)榧状枷?乙酸乙酯相>水相>乙醚相>石油醚相，而對(duì)白菜根長的抑制作用的強(qiáng)弱順序則為乙酸乙酯相>甲醇相>乙醚相>石油醚相>水相。特別是乙酸乙酯和甲醇相處理的白菜籽苗高生長均為0，對(duì)根長的抑制率也都達(dá)到了85%以上。同時(shí)，各相處理濃度越大，對(duì)白菜籽幼苗生長的抑制作用也越強(qiáng)。但通過方差分析和多重比較結(jié)果表明，對(duì)白菜苗高生長的抑制作用除不同濃度間種實(shí)乙醚相差異顯著外，其他各相濃度間差異均不顯著；對(duì)白菜根系生長的抑制作用不同濃度間內(nèi)果皮乙醚相、水相差異極顯著外，其他各相濃度間差異也均不顯著。而在相同濃度相同有機(jī)相的條件下，種實(shí)浸提物對(duì)白菜幼苗生長的影響均高于種皮提取物。如內(nèi)果皮水相0.1 g·mL-1、0.2 g·mL-1處理的白菜苗高生長比對(duì)照分別減少了54.3%、60%，白菜菜苗根長分別降低9.7%、24.9%；而種實(shí)水相在相同濃度處理下白菜苗高生長量降低了77.2%、81.8%，根長減少了50.1%、59.7%。

由此可以說明，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)各分離相對(duì)白菜籽幼苗生長也均有抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。其中相同濃度條件下，種實(shí)浸提液對(duì)白菜籽幼苗生長的抑制作用比內(nèi)果皮顯著。但不管是種實(shí)還是內(nèi)果皮，其甲醇相和乙酸乙酯相對(duì)白菜籽幼苗生長的抑制作用最強(qiáng)，表明內(nèi)果皮和種實(shí)的甲醇相和乙酸乙酯相中存在著大量的抑制物質(zhì)，且這些物質(zhì)的抑制活性都較強(qiáng)。

2.2 種子不同部位提取的有機(jī)化合物種類和相對(duì)含量

‘紫梗籽銀’桂種子的內(nèi)果皮、種實(shí)提取液經(jīng)GC-MS分析得到的總離子色譜圖見圖3、圖4。從圖中可看出兩者離子流色譜圖的峰型差異很大，個(gè)別物質(zhì)保留時(shí)間也不盡相同，但重現(xiàn)性較好。通過質(zhì)譜系統(tǒng)檢索，按峰面積歸一化法計(jì)算得出各成分相對(duì)百分含量，分析出離子流程圖中峰面積和相似度較大、可能具有抑制作用的有機(jī)化合物共有9種(表1)?！瞎Ｗ雁y’桂種實(shí)中鑒定出的有機(jī)化合物主要為脂肪酸類和苯胺類物質(zhì)，有油酸(4.208%)、棕櫚酸(1.817%)、9、12-十八碳二烯酸(1.84%)和2，4-二甲苯胺(21.689%)、3、4-二甲苯胺(4.427%)等；內(nèi)果皮浸提液中鑒定出的有機(jī)化合物也為脂肪酸類物質(zhì)，可能有抑制作用的也是棕櫚酸(4.691%)、油酸(4.022%)、9、12-十八碳二烯酸(2.264%)和2，4-二甲苯胺(24.248 %)、3、4-二甲苯胺(18.506 %)等。由此可知，‘紫梗籽銀’桂種子的內(nèi)果皮和種實(shí)中提取的抑制物質(zhì)種類比較少，主要是一些脂肪酸類和苯胺類物質(zhì)，且種實(shí)中提取的有機(jī)物種類多于內(nèi)果皮。

圖2 ‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)中抑制物對(duì)白菜籽幼苗生長的影響

圖3 ‘紫梗籽銀’桂種子種實(shí)中提取物的離子流程圖圖4 ‘紫梗籽銀’桂種子內(nèi)果皮中提取物的離子流程圖

表1 內(nèi)果皮和種實(shí)甲醇浸提液中有機(jī)化合物種類及相對(duì)含量

3 結(jié)論與討論

‘紫梗籽銀’桂種子不同部位浸提液對(duì)白菜籽的發(fā)芽率以及苗高、根長的生長均有顯著的抑制作用。且內(nèi)果皮和種實(shí)浸提液的白菜種子發(fā)芽以及幼苗生長測定結(jié)果變化趨勢(shì)大致相同，但各有機(jī)相對(duì)白菜籽發(fā)芽及幼苗生長的抑制作用不同。在相同濃度處理下，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)各分離相對(duì)白菜籽發(fā)芽率以及苗高、根長生長的抑制作用的強(qiáng)度都存在一定差異。其中，無論是‘紫梗籽銀’桂的內(nèi)果皮還是種實(shí)部分，其乙酸乙酯相和甲醇相對(duì)白菜籽發(fā)芽率以及苗高、根長生長的抑制作用均最強(qiáng)烈，尤其是對(duì)苗高生長的抑制率達(dá)到100%，故認(rèn)為‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)的乙酸乙酯相或甲醇相中存在著某些萌發(fā)抑制物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)種子的萌發(fā)及其生長的抑制活性最強(qiáng)。同時(shí)，雖然不同濃度間抑制作用的差異不顯著(可能是由于濃度梯度比較小)，但還是可以看出抑制作用會(huì)隨著各相處理濃度的增大而增強(qiáng)，這與其他植物[8-9]抑制物研究中的結(jié)論相符合?！瞎Ｗ雁y’桂內(nèi)果皮和種實(shí)中各有機(jī)相的抑制作用或程度表現(xiàn)不同的原因可能由以下幾方面引起：一是內(nèi)果皮和種實(shí)的乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相中萌發(fā)抑制物的種類，及其含量存在差異；二是各抑制物的抑制能力不盡相同。許傳蓮等[10]也曾提出一種植物種子中可能存在多種抑制物質(zhì)，但起關(guān)鍵作用的可能僅有一種或幾種，對(duì)白菜種子起抑制作用的質(zhì)量濃度對(duì)該植物種子可能無抑制作用，故‘紫梗籽銀’桂種子中所含抑制物對(duì)其自身萌發(fā)是否存在抑制作用，其自身所含抑制物的質(zhì)量濃度效應(yīng)等均有待進(jìn)一步研究。

植物種子中存在內(nèi)源抑制物質(zhì)是導(dǎo)致種子休眠的一個(gè)重要原因，相關(guān)研究也有許多。紫椴種子中存在壬酸、辛酸、棕櫚酸、十五烷酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)[11]。青錢柳種子中鑒定到的抑制物中也包括了酸、辛酸、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二乙酯和順式-9，12-十八碳二烯酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)[2]。劉艷[12]指出梭梭種子中的萌發(fā)抑制物質(zhì)主要是有機(jī)酸和酚類物質(zhì)。于海蓮等[13]從南方紅豆杉種子甲醇浸提液中分離檢測到的有機(jī)物質(zhì)主要為有機(jī)酸類、酯類、胺類、醇類和酮類等。本試驗(yàn)中，經(jīng)GC-MS分析鑒定結(jié)果顯示，‘紫梗籽銀’桂內(nèi)果皮和種實(shí)中存在多種有機(jī)化合物，這些化合物主要以脂肪酸類(油酸、棕櫚酸和十八烯酸)、苯胺類(鄰、間二甲苯胺)為主，它們對(duì)種子萌發(fā)都有抑制作用，但它們的作用機(jī)制和作用方式還不清楚?？梢姺N子中的內(nèi)源抑制物種類具有多樣性，因此在考慮內(nèi)源抑制物對(duì)種子休眠的影響時(shí)，不能簡單地認(rèn)為是某種抑制物質(zhì)作用的結(jié)果，探究哪一種或幾種真正起抑制作用還有待于深入研究。而且本次試驗(yàn)由于受氣相色譜數(shù)據(jù)分析軟件的限制，還有一部分含量較高但匹配度低于70%的化合物，至今未能明確其主要成分，其種子萌發(fā)是否具有抑制作用還有待進(jìn)一步分析。

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The Analysis of Inhibitor Substance for Seeds ofOsmanthusfragrans′Zigengziyin′

SHI Ting-ting，YANG Xiu-lian，WANG Liang-gui

(CollegeofLandscapeArchitecture，NanjingForestryUniversity，Nanjing210037，Jiangsu，China)

WithOsmanthusfragrans′Zigengziyin′ seeds as the test materials，its endocarp and endogenesis inhibitory substance was extracted，bioassayed and then identified by GC-MS.The result indicated that：①there were some substance inhibiting seed germination and seedling growth in both endocarp and endogenesis ofO.fragrans′Zigengziyin′ seeds，and the inhibitory effect of disperse phases in endocarp and endogenesis were different. Among these the inhibition of petroleum ether phase was weakest，while the ethyl acetate phase and methanol phase had higher inhibitory effects.②The GC-MS results show that there were many inhibiting substances in both endocarp and endogenesis，including some germination inhibiting substances，such as Palmitic acid，oleic acid，9，12-octadecaienoic acid，etc，fatty acid are the major ingredients.

Osmanthusfragrans′Zigengziyin′；seeds；inhibitory substance；germination rate；seedling growth；GC-MS

2014-07-05；

2014-08-28

江蘇省科技支撐項(xiàng)目(BE2011367)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程基金資助項(xiàng)目(PAPD)

施婷婷(1989—)，女，江蘇南通人，南京林業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院碩士研究生，從事園林植物應(yīng)用研究。E-mail：shitingting313@163.com。

王良桂，教授，博導(dǎo)。E-mail：wlg@nifu.com.cn。

10.13428/j.cnki.fjlk.2015.02.023

S685.13

A

1002-7351(2015)02-0103-05