張玉霞，周　丹，吳敏亮，李　燕，楊鈺瑩，陳　亮（廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廈門(mén)市植物遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102）

NRRB在水稻應(yīng)答高鹽和干旱脅迫中的功能解析

張玉霞，周丹，吳敏亮，李燕，楊鈺瑩，陳亮
（廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廈門(mén)市植物遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361102）

為研究NRRB在水稻抗逆反應(yīng)中的作用，通過(guò)重疊延伸PCR擴(kuò)增NRRB基因編碼區(qū)，構(gòu)建超量表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株。鑒定結(jié)果表明，該基因已被整合到水稻基因組中，并實(shí)現(xiàn)超量表達(dá)；同時(shí)構(gòu)建了抑制表達(dá)載體，獲得轉(zhuǎn)基因株系，PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)NRRB基因在轉(zhuǎn)基因水稻中受到明顯抑制。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗旱性、耐鹽性分析，結(jié)果顯示，超量表達(dá)NRRB基因增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱的抗性，抑制表達(dá)NRRB基因的轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)干旱的敏感性增強(qiáng)，表明NRRB正調(diào)控水稻對(duì)干旱的抗性；耐鹽性分析表明，NRRB基因的抑制表達(dá)降低了植株對(duì)鹽的敏感性。

NRRB；超量表達(dá)載體；RNAi表達(dá)載體；轉(zhuǎn)基因水稻

水稻Oryza sativa是重要的糧食作物，但由于各種非生物脅迫，水稻產(chǎn)量受到嚴(yán)重制約［1—2］。在非生物脅迫中，鹽堿和干旱是制約植物生長(zhǎng)的兩個(gè)主要脅迫因素［3］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前世界上約 22%耕種土地是鹽堿地，接近 50%灌溉土地受到鹽脅迫的危害［4—5］。而且，干旱和鹽漬化面積擴(kuò)張迅速，至 2050年，預(yù)計(jì)將有50%以上的可耕地面積嚴(yán)重鹽堿化［6］。

植物在遇到非生物脅迫時(shí)，其形態(tài)和生理生化代謝將發(fā)生變化，以適應(yīng)或忍耐環(huán)境脅迫［7］。植物與脅迫相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)及代謝物構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄控制發(fā)揮著重要作用［8］。研究表明，多數(shù)植物類(lèi)受體激酶（Receptor-like kinase，RLK）基因參與鹽、高溫、冷害、干旱和重金屬等非生物脅迫應(yīng)答，如OsSIK1（stress induced protein kinase 1，SIK1）是水稻的一種RLK，在水稻抵抗鹽害和干旱脅迫中發(fā)揮重要作用［9］。與野生型植株相比，突變體sik1-1和sik1-2對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性降低；相反，過(guò)量表達(dá) OsSIK1基因可提高轉(zhuǎn)基因植株超氧化物歧化酶含量，H2O2等活性氧含量降低，植株表現(xiàn)出更好的逆境耐受力。

NRRB基因位于水稻10號(hào)染色體，編碼一個(gè)胞質(zhì)RLK，含1個(gè)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和1個(gè)U-box結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過(guò)生物芯片分析，該基因?qū)Ψ巧锩{迫具有響應(yīng)能力。本文從生物信息學(xué)、超表達(dá)、RNAi及轉(zhuǎn)基因植株耐旱性、耐鹽性等方面分析評(píng)估轉(zhuǎn)基因植株對(duì)逆境的抗性，進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)基因植株抗逆性增強(qiáng)的分子機(jī)理，以加深對(duì)水稻逆境脅迫應(yīng)答信號(hào)網(wǎng)絡(luò)組分的認(rèn)識(shí)，為篩選具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的功能基因提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

植物材料為粳稻 Oryza sativ a subsp. japonica品種‘臺(tái)北 309’（TP309）；克隆菌株為大腸桿菌Escherichia coli DH5α；用于Gateway技術(shù)的中間載體pENTRTM/D-TOPO購(gòu)自Invitrogen公司；表達(dá)載體為 pCAMBIA-1301 Vector；干擾表達(dá)載體 pH7GWIWG2（II）；根癌農(nóng)桿菌菌株為 Agrobacterium tumefaciens EHA105；限制性?xún)?nèi)切酶BglII、BstEII購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1水稻基因組總RNA提取及cDNA合成采用Trizol試劑（Invitrogen，上海） 提取水稻不同組織總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa，大連）合成cDNA第一鏈。

1.2.2NRRB超量表達(dá)載體構(gòu)建以攜帶NRRB基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒DNA為模板，用引物1301-f 和1301-r（表1）以及高保真pfu DNA 聚合酶擴(kuò)增NRRB基因cDNA全長(zhǎng)，擴(kuò)增片段為2700 bp。PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各 1 μL，DNA模板1 μL，pfu DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃3 min。PCR產(chǎn)物膠回收后，連接pMD18-T Vector后測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在第1600 bp處缺失兩個(gè)堿基AG，于是根據(jù)重疊延伸PCR原理［10］，重新設(shè)計(jì)引物，引物由Invitrogen公司合成。

兩對(duì)引物YWx1-f、YWx1-r與YWx2-f、YWx2-r（表1）分別用來(lái)擴(kuò)增前1600 bp和后1100 bp，最后再用引物1301-f、1301-r做重疊延伸PCR，擴(kuò)增全長(zhǎng)2700 bp的CDS區(qū)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，經(jīng)BglII 與BstEII酶切后，再進(jìn)行凝膠回收，然后連接到經(jīng)過(guò)BglII和BstEII酶切的pCAMBIA1301雙元載體上，最終獲得包含CaMV35S啟動(dòng)子和NRRB基因的超量表達(dá)載體pCAMBIA1301-NRRB。將超量表達(dá)載體采用凍融法導(dǎo)入EHA105中，挑選菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆，搖菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　載體構(gòu)建及鑒定所用引物Table 1　Primers used for the construction of the expression vectors and identification assays

1.2.3NRRB抑制表達(dá)載體構(gòu)建以超表達(dá)重組載體pCAMBIA1301-NRRB的質(zhì)粒DNA為模板，利用高保真pfu DNA聚合酶及上下游引物OsNRRBi-f和OsNRRBi-r（表1），擴(kuò)增位于CDS區(qū)第1550～1895 bp處的NRRB干擾片段。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 2 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，DNA模板1 μL，pfu DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s。PCR得到大小為346 bp的干擾片段，將此片段回收純化后，通過(guò)TOPO反應(yīng)定向克隆到入門(mén)載體pENTRTM/D-TOPO上，再通過(guò)invitrogen的Gateway LR重組反應(yīng)將目的片段插入表達(dá)載體pH7GWIWG2（II）。將干擾表達(dá)載體采用凍融法導(dǎo)入EHA105中，挑選菌落PCR鑒定為陽(yáng)性的單克隆，搖菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)根據(jù)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 Hyg和啟動(dòng)子 P35S序列設(shè)計(jì)特異引物 Hyg-S、Hyg-A和P35S-S、P35S-A（表1），對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，野生型植株為對(duì)照。擴(kuò)增1421 bp Hyg基因片斷和942 bp啟動(dòng)子P35S片段。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Taq Mix 5 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.5基因表達(dá)分析以三葉期水稻葉片提取轉(zhuǎn)基因植株和野生植株總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA，以此為模版，以NRRB-real-f1、NRRB-real-r1和Actin-rq-F、Actin-rq-R為引物（表1），PCR擴(kuò)增基因actin和NRRB，其中actin為內(nèi)參基因。

熒光定量PCR（qRT-PCR）的反應(yīng)體系為：2×SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 5 μL，上下游引物各0.4 μL，各取1 μL cDNA模板，ROX Reference Dye 0.2 μL，用雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)72 ℃延伸最后5 s進(jìn)行熒光采集。定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法對(duì)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析［11］。每樣品3個(gè)重復(fù)，每實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6轉(zhuǎn)基因植株抗逆性分析水稻TP309種子催芽后，置于固定在組培瓶的紗布上培養(yǎng)（組培瓶中盛滿(mǎn)新鮮營(yíng)養(yǎng)液，并以浸濕紗布為準(zhǔn)），萌發(fā)2 d后，挑選萌發(fā)一致的轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻萌發(fā)種子，分別轉(zhuǎn)移至含20% PEG或150 mmol·L-1甘露醇（Mannitol）的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行抗旱性分析。生長(zhǎng)12 d后觀察表型，并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)指標(biāo)變化。另取一部分萌發(fā)一致的種子分別轉(zhuǎn)移至含150 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行耐鹽性分析。生長(zhǎng)10 d后觀察表型，并統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)指標(biāo)變化。

2　結(jié)果與分析

2.1NRRB基因及其編碼蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

通過(guò)搜索RGAP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://rice.plantbiology.msu.edu），獲得NRRB基因及其編碼蛋白的信息，基因位于水稻10號(hào)染色體上，基因序列全長(zhǎng)5160 bp，有兩個(gè)不同的剪接變體，本實(shí)驗(yàn)中研究的是變體一，即LOC_Os1040100.1。NRRB基因變體一包含9個(gè)外顯子8個(gè)內(nèi)含子（圖1），該基因編碼的蛋白屬于PKc-like superfamily，是一個(gè)含900個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，預(yù)測(cè)蛋白分子量為99.4 KD，等電點(diǎn)為6.42。

圖1　NRRB基因組DNA結(jié)構(gòu)和預(yù)測(cè)的蛋白結(jié)構(gòu)Fig. 1　The structure of NRRB and its putative protein

2.2轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及檢測(cè)

2.2.1超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及檢測(cè)以攜帶NRRB基因全長(zhǎng)cDNA的質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增基因并連接到pMD18-T載體，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)在第1600 bp處有堿基缺失。根據(jù)重疊延伸PCR原理重新設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建好NRRB基因的超量表達(dá)載體（圖2：A），分別擴(kuò)增缺失位點(diǎn)前后兩片段即片段一、片段二（圖2：B），重疊延伸PCR獲得全長(zhǎng)序列（圖2：C），最終用NcoI酶切對(duì)重組載體pCAMBIA1301-NRRB進(jìn)行酶切鑒定，得到1686bp的目的條帶（圖2：D），結(jié)果表明該基因已被成功插入表達(dá)載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建好的NRRB超量表達(dá)重組載體導(dǎo)入水稻TP309中，經(jīng)組織培養(yǎng)后，共轉(zhuǎn)化獲得23株超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。分別取轉(zhuǎn)基因水稻植株和野生型水稻葉片，提取基因組 DNA，并用啟動(dòng)子P35S特異引物P35S-S/P35S-A和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因特異引物Hyg-S/Hyg-A進(jìn)行PCR檢測(cè)。大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻能擴(kuò)增出與預(yù)期片段大小一致的目的片段，而野生型不能擴(kuò)增出目的片段（圖2：E、F），說(shuō)明目的基因已成功整合進(jìn)水稻基因組中，得到了成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻植株。

圖2　PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株Fig. 2　Identification of the transgenic plants by PCR

2.2.2抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻檢測(cè)以pCAMBIA1301-NRRB質(zhì)粒為模板，用基因特異性引物OsNRRBi-f 和OsNRRBi-r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為346 bp的干擾片段（圖3：A）。將此片段回收純化后，通過(guò)TOPO反應(yīng)定向克隆到入門(mén)載體pENTRTM/D-TOPO上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆并進(jìn)行PCR鑒定（圖3：B），將陽(yáng)性克隆測(cè)序。經(jīng)比對(duì)正確后，以上述陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒為模板，通過(guò)重組反應(yīng)將目的片段插入到表達(dá)載體pH7GWIWG2（II）中（圖3：C）。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序、比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與目的序列一致，說(shuō)明干擾片段已被成功構(gòu)建到表達(dá)載體中。采用特異引物Hyg-S/A和P35S-S/A對(duì)抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，以轉(zhuǎn)基因水稻植株基因組DNA為模板的PCR大多能分別擴(kuò)增到1421 bp和942 bp的DNA 片段（圖3：D、E），而野生型植株則不能擴(kuò)增到這樣的條帶，說(shuō)明大多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻植株的基因組已成功整合了目的片段。

2.3轉(zhuǎn)基因植株中NRRB基因的表達(dá)水平

取12棵PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的超量表達(dá)T0代轉(zhuǎn)基因植株（分別命名為OE1～12）進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示，除了OE7外，其他超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的NRRB表達(dá)量均比野生型高，說(shuō)明這些轉(zhuǎn)基因水稻植株實(shí)現(xiàn)NRRB的超量表達(dá)。其中，OE8、OE9、OE10的NRRB基因表達(dá)量比野生型水稻高出20倍以上（圖4：A），可用于后續(xù)基因功能分析實(shí)驗(yàn)。同樣選取11棵 PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的抑制表達(dá)T0代轉(zhuǎn)基因植株（分別命名為 RNAi1～11），檢測(cè)目的基因NRRB的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，相對(duì)于野生型植株，NRRB基因在所選植株中的表達(dá)量均有不同程度的下降（圖4：B），選取株系RNAi7、RNAi9作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料。

圖3　PCR檢測(cè)抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株Fig. 3　Identification of the inhibition transgenic plants by PCR

圖4　T0代轉(zhuǎn)基因植株中NRRB基因的表達(dá)Fig. 4　Relative expression levels of NRRB in the T0 transgenic plants

2.4T1代NRRB基因超量表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性分析

為了解NRRB在逆境脅迫應(yīng)答中的功能，首先對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在高滲、高鹽處理下的表型進(jìn)行分析。耐鹽性結(jié)果表明，在1/2MS培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株之間沒(méi)有明顯的表型差異（圖5：A）；在含150 mmol·L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，超量表達(dá)植株株高低于野生型（23%），且存在顯著性差異；而抑制表達(dá)植株則比野生型高（15%）（圖5：B）。因此，NRRB基因的抑制表達(dá)降低了植株對(duì)鹽的敏感性。

圖5　T1代NRRB轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析Fig. 5　Analysis of salinity tolerance of the T1 NRRB transgenic plants

A. 正常情況和高鹽脅迫下生長(zhǎng)10 d的野生型和NRRB轉(zhuǎn)基因植株的表型；B. 對(duì)應(yīng)的株高?！?”和“**”分別表示轉(zhuǎn)基因和野生型植株之間差異顯著（P＜0.05）和極顯著（P＜0.01），圖6同。

2.5T1代NRRB基因超量表達(dá)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株耐旱性分析

耐旱性實(shí)驗(yàn)表明，在PEG脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的長(zhǎng)勢(shì)明顯高于野生型幼苗（圖6：A、B），超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因幼苗的鮮重顯著高于野生型幼苗（圖6：C），株高要比對(duì)照高出16.8%，差異顯著；鮮重差異極顯著，高出29.8%。抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株幼苗長(zhǎng)勢(shì)明顯比野生型弱（圖6：A），株高較對(duì)照低12.1%，鮮重也相應(yīng)下降26.1%（圖6：B、C）。然而，在正常生長(zhǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因水稻幼苗的表型沒(méi)有明顯變化，相應(yīng)的生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照沒(méi)有顯著差異。由此說(shuō)明，NRRB超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)模擬干旱脅迫的抗性增強(qiáng)，NRRB抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)模擬干旱脅迫的抗性減弱。甘露醇模擬干旱處理結(jié)果與PEG 處理表現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻幼苗株高要比對(duì)照高出21.1%，鮮重也高出1.4%；而抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)勢(shì)明顯比野生型弱，株高較對(duì)照低18.4%，鮮重變化不大（圖6：D、E、F），進(jìn)一步證實(shí)超量表達(dá)NRRB基因可提高水稻抗旱性。

圖6　T1代NRRB轉(zhuǎn)基因植株耐旱性分析Fig. 6　Analysis of drought tolerance of the T1 NRRB transgenic plangts

3　討論

蛋白激酶普遍存在于各種生物體內(nèi)，植物類(lèi)受體激酶是植物體內(nèi)信號(hào)分子的重要受體，幾乎參與所有的細(xì)胞代謝過(guò)程，包括生長(zhǎng)發(fā)育、表達(dá)調(diào)控和逆境反應(yīng)等［12—13］。NRRB基因編碼一個(gè)含900個(gè)氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，本研究中通過(guò)重疊延伸PCR方法克隆了基因編碼區(qū)序列，并進(jìn)一步構(gòu)建了超量和抑制表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，為后續(xù)研究奠定良好基礎(chǔ)。

高鹽和干旱都會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞缺水，打亂細(xì)胞的水平衡，還可引起蛋白質(zhì)等大分子變性，破壞植物細(xì)胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)等［14—15］，是制約植物生長(zhǎng)的兩個(gè)主要脅迫因素，也是全球糧食減產(chǎn)的主要因素［16—17］。在逆境下生長(zhǎng)的植物，對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)涉及到脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及體內(nèi)代謝的變化，脅迫相關(guān)基因、蛋白質(zhì)及代謝物構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本文在對(duì)T1代NRRB轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行逆境脅迫處理時(shí)發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)NRRB的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)出耐旱性及鹽敏感性。這種對(duì)逆境的不同抗性，預(yù)示NRRB作為一個(gè)蛋白激酶，其功能具有多樣性，可以通過(guò)不同的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與到逆境脅迫途徑中，但具體通過(guò)何種途徑調(diào)控還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］ Hirayama T， Shinozaki K. Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era: past， present and future［J］. The Plant Journal， 2010，61: 1041—1052.

［2］ Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants［J］. Annual Review of Plant Biology， 2002， 53（1）: 247—273.

［3］ Vickers C E， Gershenzon J， Lerdau M T， Loreto F. A unified mechanism of action for volatile isoprenoids in plant abiotic stress［J］. Nature Chemical Biology， 2009，5: 283—291.

［4］ Vinocur B， Altman A. Recent advances in engineering plant tolerance to abiotic stress: achievements and limitations［J］. Current Opinion in Biotechnology， 2005，16: 123—132.

［5］ Zhu J K. Plant salt tolerance［J］. Trends in Plant Science， 2001，6（2）: 66—70.

［6］ Cattivelli L， Baldi P， Crosatti C， Fonzo N D， Faccioli P， Grossi M， Mastrangelo A M， Pecchioni N， Stanca A M. Chromosome regions and stress-related sequences involved in resistance to abiotic stress in Triticeae［J］. Plant Molecular Biology， 2002，48: 649—665.

［7］ Hong Z L， Zhang Z M， Desh P S. Removal of feedback inhibition of Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress［J］. Plant Physiology， 2000，122:1129—1136.

［8］ Caplan， Jeffrey， Padmanabhan， Meenu， Dinesh K， Savithramma P. Plant NB-LRR immune receptors: From recognition to transcriptional reprogramming［J］. Cell Host & Microbe， 2008，3（3）: 126—135.

［9］ Ouyang S Q， Liu Y F， Liu P， Lei G， He S J， Ma B， Zhang W K， Zhang J S， Chen S Y. Receptor-like kinase OsSIK1 improves drought and salt stress tolerance in rice （Oryza sativa） plants［J］. The Plant Journal， 2010，62（2）: 316—329.

［10］ Horton R M， Cai Z L， Ho S N， Pease L R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain［J］. Biotechniques， 1990，8: 528—535.

［11］ Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod［J］. Methods， 2001，25: 402—408.

［12］ Morris E R， Walker J C. Receptor- like protein kinases: the keys to response［J］. Current Opinion in Plant Biology， 2003，6: 339—342.

［13］ Vij S， Giri J， Dansana P K， Kapoor S， Tyagi A K. The receptor-like cytoplasmic kinase（OsRLCK） gene family in rice: organization， phylogenetic relationship， and expression during development and stress［J］. Molecular Plant， 2008，1: 732—750.

［14］ 楊少輝，季靜，王罡，宋英今. 鹽脅迫對(duì)植物影響的研究進(jìn)展［J］. 分子植物育種， 2006，4（S1）: 139—142.

［15］ Skirycz A， Inze D. More from less: plant growth under limited water［J］. Current Opinion in Biotechnology， 2010，21（2）: 197—203.

［16］ 趙雅靜，翁伯琦，王義祥，徐國(guó)忠. 植物對(duì)干旱脅迫的生理生態(tài)響應(yīng)及其研究進(jìn)展［J］. 福建稻麥科技， 2009，27（2）: 45—50.

［17］ Osakabe Y， Osakabe K， Shinozaki K， Tran S L. Response of plants to water stress ［J］. Frontiers in Plant Science， 2014，5: 86.

Functional Analysis of NRRB in Rice Response to Salt and Drought Stresses

ZHANG Yu-xia， ZHOU Dan， WU Min-liang， LI Yan， YANG Yu-ying， CHEN Liang
（Xiamen Key Laboratory for Plant Genetics， School of Life Sciences， Xiamen University， Xiamen 361102， Fujian China）

To explore the role of NRRB protein in rice resistance to abiotic stress， we amplified gene coding region by overlap extension PCR， constructed over-expression vector， and transformed into rice callus then obtained transgenic lines. The identification results showed that NRRB gene had been integrated into the rice genome， and was overexpressed in positive transgenic plants. Meanwhile，interference expression vector was constructed and transgenic lines were obtained， PCR result confirmed that the expression of NRRB was notably downregulated. The research on drought resistance in the T1 generation of transgenic plants indicated that overexpressing NRRB improved resistance of the transgenic plants to drought， and suppressing its expression enhanced susceptibility of the transgenic plants to drought， indicating that NRRB positively regulates resistance of rice to drought. The results of salt tolerance showed that suppressing NRRB reduced the susceptibility of the transgenic plants to salt.

NRRB； over-expression vector； RNAi-expression vector； transgenic rice

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.04.001

Q943.2

A

1009-7791（2015）04-0267-07

2015-10-23

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）前期研究專(zhuān)項(xiàng)（No. 2011ZX08001-001）

張玉霞，博士研究生，從事植物基因工程研究。E-mail: zyxia2010@126.com

注：陳亮為通訊作者。E-mail: chenlg@xmu.edu.cn