李 宏，李德華，胡 波

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121000；2.撫順市第四醫(yī)院，遼寧 撫順 113000）

乳腺癌以23%的女性惡性腫瘤占有率成為近年來惡性腫瘤增長幅度最大的腫瘤，且呈年輕化趨勢[1]。乳腺彩色多普勒超聲檢查是乳腺癌早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷的基礎(chǔ)方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后與多種基因蛋白的突變和異常表達(dá)相關(guān)。Ki67、p53等生物學(xué)指標(biāo)在乳腺癌病情發(fā)展、治療和預(yù)后的判斷有重要的臨床價值。

國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，Ki67是核增殖相關(guān)蛋白，能有效評估腫瘤細(xì)胞增殖活性[2-3]。Ki67的表達(dá)是乳腺癌研究的重要指標(biāo)，其表達(dá)的高低反映腫瘤細(xì)胞的增殖情況，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面顯著相關(guān)[4-5]。p53是腫瘤中最易發(fā)生突變的抑癌基因，分野生型和突變型。野生型p53通過提高DNA修復(fù)能力抑制細(xì)胞增殖及分化。突變型失去正常抑癌作用，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而誘發(fā)腫瘤。研究表明，p53在正常乳腺組織不表達(dá)，而在乳腺癌組織中過度表達(dá)，p53是乳腺癌分期、分級和病理分型的獨立預(yù)測指標(biāo)[6]。目前，臨床主要通過術(shù)后組織活檢標(biāo)本的免疫組化染色來判定Ki67、p53的表達(dá)，本文旨在通過術(shù)前的非侵襲性超聲影像學(xué)方法預(yù)測及評估Ki67、p53的表達(dá)，進(jìn)而分析超聲征象與Ki67、p53表達(dá)的相關(guān)性，為乳腺癌非手術(shù)治療、術(shù)前及術(shù)后風(fēng)險評估提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集遼寧省撫順市第四醫(yī)院2013年12月—2014年6月保存的乳腺癌患者術(shù)后標(biāo)本135例，均經(jīng)病理檢查確診，資料完整?；颊呔鶠榕?，年齡23～78 歲，平均年齡（45.28±8.71）歲，中位年齡 46歲。所有病例術(shù)前均行彩色多普勒超聲檢查，未行放療、化療及內(nèi)分泌治療。術(shù)后對腫瘤標(biāo)本進(jìn)行Ki67、p53免疫組化指標(biāo)檢測。

1.2 儀器及方法

應(yīng)用美國GE公司Logiq P6彩色多普勒超聲診斷儀，探頭為11L。檢查時患者仰臥，使用高頻探頭經(jīng)體表直接檢查，首先檢查乳腺，最后檢查腋窩，觀察有無腫大淋巴結(jié)及其形態(tài)改變、血流情況。發(fā)現(xiàn)腫塊時記錄其聲像圖特征，重點記錄腫塊大小、邊緣、形態(tài)，鈣化的分布、形態(tài)，腫塊邊界是否清晰、周邊血流分布及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。彩色血流顯像分級按Adler血流分級法，為0～1級和2～3級。

1.3 主要試劑

兔抗人Ki67單克隆抗體SP6，兔抗人p53單克隆抗體SP5，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液（pH=6.0），Elivison二步法免疫組化檢測試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。其余試劑均由遼寧醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提供。

1.4 免疫組織化學(xué)方法

采用免疫組化方法檢測組織Ki67、p53的表達(dá)。組織標(biāo)本用10%福爾馬林固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm厚連續(xù)切片，60℃烤片3 h。免疫組化染色：①石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟。②對組織抗原進(jìn)行高壓熱修復(fù)（220℃，2 min）：檸檬酸抗原修復(fù)液（0.01 M，pH6.0）。③3%H2O2室溫下孵育 10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗3次（5 min/次）。④滴加一抗：Ki67、p53均采用即用型工作液。室溫孵育60 min，PBS沖洗3次（5 min/次）。⑤滴加試劑：滴加聚合物增強(qiáng)劑（試劑A），孵育20 min，PBS沖洗后滴加酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物（試劑B），孵育30 min。⑥滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色滿意后終止反應(yīng)。⑦蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染3～5 min，1%鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗30 min。⑧梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。每次以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

隨機(jī)選取10個高倍視野，計數(shù)每個視野中的陽性細(xì)胞，并取平均值。Ki67、p53的表達(dá)以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色。根據(jù)切片所選視野中陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的比例將其分為：陽性＜10%為陰性（-），10%～25%為（+），26%～50%為（++），≥51%為（+++）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，運用χ2檢驗和Spearman秩相關(guān)檢驗。分析結(jié)果以差異P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲征象特征

超聲影像顯示：135例患者中，42例腫塊＜2 cm，93例腫塊≥2 cm；78例腫塊邊緣有毛刺；50例腫塊呈不規(guī)則形，36例呈分葉狀，49例呈類圓形。107例患者鈣化，36例散在分布，44例簇狀分布，27例沿導(dǎo)管走向；鈣化形態(tài)以細(xì)沙狀為主，占53例；血流顯像分級以2～3級為主，占102例；63例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；41例侵犯周圍組織，見圖1。

2.2 Ki67、p53在乳腺癌中的表達(dá)

在135例乳腺癌組織中，Ki67有87例表達(dá)陽性，陽性率64.4%（87/135），p53有69例表達(dá)陽性，陽性率 51.1%（69/135），見圖2，3。

2.3 Ki67、p53的表達(dá)與超聲征象的關(guān)系

圖1 彩色多普勒超聲征象。圖1a：59歲，乳房腫瘤4.5 cm×2.6 cm，形態(tài)不規(guī)則。圖1b：40歲，乳房腫瘤形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)伴多發(fā)鈣化。圖1c：59歲，乳房腫瘤形態(tài)不規(guī)則，血流信號豐富。圖1d：56歲，腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Figure 1. Color Doppler ultrasonography.Figure 1a:59 years old,breast tumor by 4.5 cm×2.6 cm with an irregular shape.Figure 1b:40 years old,breast tumor with an irregular shape and multiple calcification.Figure 1c:59 years old,breast tumor with an irregular shape and rich blood flow signal.Figure 1d:56 years old,with axillary lymph node metastasis.

圖2 乳腺癌組織中 Ki67 的表達(dá)。圖2a：陰性（-）；圖2b～2d：Ki67 陽性表達(dá)于細(xì)胞核，圖2b：（+），圖2c：（++），圖2d：（+++）。Figure 2. The expression of Ki67 in breast cancer.Figure 2a:negative(-);Figure 2b～2d:Positive expression of Ki67 in the nucleus,Figure 2b:(+),Figure 2c:(++),Figure 2d:(+++).

圖3 乳腺癌組織中 p53 的表達(dá)。圖3a：陰性（-）；圖3b～3d：p53 陽性表達(dá)于細(xì)胞核，圖3b：（+），圖3c：（++），圖3d：（+++）。Figure 3. The expression of p53 in breast cancer.Figure 3a:negative(-);Figure 3b～3d:Positive expression of p53 in the nucleus,Figure 3b:(+),Figure 3c:(++),Figure 3d:(+++).

Ki67、p53表達(dá)與血流顯像分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織有顯著性相關(guān)（P＜0.05），可見 Ki67、p53表達(dá)水平增高，血流顯像分級越高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會越大，侵犯周圍組織的可能性也越大。Ki67與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)有顯著相關(guān)性（P＜0.05），與鈣化分布無相關(guān)性（P＞0.05），而p53與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)無相關(guān)性（P＞0.05），與鈣化分布有顯著性相關(guān)（P＜0.05），可見 Ki67、p53在腫塊形態(tài)、鈣化分布、鈣化形態(tài)方面表達(dá)的相關(guān)性上有差異。Ki67、p53表達(dá)與腫塊大小、腫塊邊緣無相關(guān)性（P＞0.05）。見表1。

表1 乳腺癌Ki67、p53表達(dá)與超聲征象的關(guān)系

2.3 Ki67表達(dá)與p53表達(dá)的關(guān)系

Ki67與p53表達(dá)程度呈正相關(guān)（r=0.617，P＜0.05），見表2。

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是由多基因、多因素突變的結(jié)果。在乳腺組織癌變的進(jìn)程中，相關(guān)基因Ki67、p53表達(dá)的改變從不同層面反映了乳腺癌的惡性程度及組織病理學(xué)改變，從而形成了多種影像學(xué)表現(xiàn)。Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，反映早期乳腺癌細(xì)胞增殖狀態(tài)，其表達(dá)率增高，提示乳腺癌細(xì)胞的惡性程度大，腫瘤生長速度快，侵襲力強(qiáng)，發(fā)生轉(zhuǎn)移較早，預(yù)后差，是指導(dǎo)乳腺癌早期診斷及評價預(yù)后的理想指標(biāo)[7]。Sasano[7]研究表明Ki67表達(dá)水平反映腫瘤細(xì)胞的活性，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后顯著相關(guān)。p53分野生型和突變型，突變型p53幾乎表達(dá)于所有的惡性腫瘤中，乳腺癌中有20%～60%p53基因發(fā)生突變。p53過度表達(dá)或突變會增加乳腺正常組織及良性病變向乳腺癌發(fā)展的風(fēng)險。Kobayashi等[8]研究報道，p53細(xì)胞增殖指數(shù)和突變率低，應(yīng)與Ki67聯(lián)檢來區(qū)分乳腺癌類型。本實驗通過對乳腺癌患者聯(lián)檢Ki67、p53組織病理學(xué)形態(tài)改變，分析其與乳腺癌超聲影像征象之間存在的關(guān)聯(lián)性。

表2 乳腺癌組織中Ki67、p53表達(dá)的關(guān)系

本實驗結(jié)果顯示，Ki67陽性率64.4%，p53陽性率51.1%。彩色多普勒超聲顯示Ki67、p53表達(dá)與腫塊大小、腫塊邊緣無相關(guān)性。Ki67、p53的表達(dá)在血流顯像分級（2～3級），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性及侵犯周圍組織的病例中較血流顯像分級（0～1級），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性及腫瘤未侵犯周圍組織的病例明顯增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。超聲顯像提示血流顯像分級越高，血流越豐富，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移機(jī)會越多，侵犯周圍組織的可能性也越大，此結(jié)果表明Ki67、p53的陽性表達(dá)與血流顯像分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織呈顯著性相關(guān)，這與Ki67、p53高表達(dá)水平可提示腫瘤惡性程度較高相一致。de Azambuja等[9]對文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Ki67高表達(dá)比例增加，預(yù)后差，提示Ki67可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移并造成不良預(yù)后。Vincent-Salomon等[10]，Kerlikowske等[11]研究結(jié)果顯示在乳腺原位癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Ki67和p53高表達(dá)，可作為乳腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移及預(yù)后復(fù)發(fā)的高風(fēng)險生物標(biāo)志物。本研究顯示Ki67與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)顯著性相關(guān)，與鈣化分布無相關(guān)性，類圓形腫塊Ki67的陽性表達(dá)率（79.6%）高于不規(guī)則形（62.0%）和分葉狀（47.2%），桿狀鈣化Ki67的陽性表達(dá)率（81.8%）顯著高于細(xì)沙狀鈣化（67.9%）和顆粒狀鈣化（47.6%），由此推斷超聲表現(xiàn)為類圓形腫塊及桿狀鈣化的乳腺癌，其組織結(jié)構(gòu)紊亂，增殖指數(shù)及惡性程度高，預(yù)后較差。而p53與腫塊形態(tài)、鈣化形態(tài)無相關(guān)性，與鈣化分布有顯著性相關(guān)，p53的陽性表達(dá)率在沿導(dǎo)管走向的鈣化分布（74.1%）明顯高于散在分布（41.7%）和簇狀分布（52.3%），提示超聲表現(xiàn)為鈣化沿導(dǎo)管走向的乳腺癌組織壞死越明顯，越容易導(dǎo)致鈣化，其惡性程度越高?？梢奒i67、p53在腫塊形態(tài)、鈣化分布、鈣化形態(tài)方面表達(dá)的相關(guān)性上存在差異，但未見相關(guān)文獻(xiàn)報道，還需進(jìn)一步研究予以證實。Ki67與p53表達(dá)呈正相關(guān)，說明兩者在腫瘤生長進(jìn)程中起相互協(xié)同和調(diào)節(jié)的作用。在乳腺癌的研究中，Ki67與p53聯(lián)檢可以相互補(bǔ)充、相互印證，較充分的評估乳腺癌的惡性程度及預(yù)后效果。

綜上所述，超聲征象能清楚顯示乳腺癌的形態(tài)學(xué)改變，是乳腺癌早期檢查的可靠方法。而Ki67、p53表達(dá)能從組織學(xué)方面反映乳腺癌的生物學(xué)變化。乳腺癌超聲征象與Ki67、p53表達(dá)之間具有一定的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。超聲征象從一定程度上體現(xiàn)Ki67、p53的表達(dá)情況，可作為預(yù)測乳腺癌患者Ki67、p53表達(dá)水平的無創(chuàng)性手段，進(jìn)而為乳腺癌非手術(shù)治療、術(shù)前診斷及預(yù)后評估提供指導(dǎo)依據(jù)。

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