帕爾哈提·買買提依明　令狐晨　朱青梅等

摘要 [目的]探討昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對人結腸癌細胞株（HCT116細胞、CACO2細胞）增殖的抑制作用。[方法]體外培養(yǎng)結腸癌細胞，采用不同濃度昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對其進行干預，MTT法檢測細胞生長抑制率，流式細胞儀測細胞凋亡率。[結果]MTT法檢測昆侖雪菊中總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對結腸癌細胞株的抑制作用具有濃度和時間依賴性；流式細胞儀檢測昆侖雪菊總黃酮純化物能增強結腸癌細胞株的凋亡率，且劑量與凋亡率呈正相關。[結論]昆侖雪菊總黃酮純化物抗腫瘤活性優(yōu)于總黃酮粗提物及總多糖，且對結腸癌細胞株的增殖有明顯抑制作用，其作用機制可能與增強細胞凋亡有關。

關鍵詞 昆侖雪菊；結腸癌細胞；生長抑制；細胞凋亡；抗腫瘤

中圖分類號 S567.21+9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）20-146-03

Abstract [Objective]To investigate the anti-proliferative effect of the total flavonoids， the total polysaccharides from Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain on the colorectal cancer cells. [Method] The colorectal cancer cells were cultured in vitro. The total flavonoids and the total polysaccharides of Coreopsis Ticntoria flowers interene the cells. The viability of cells was measured by MTT. The cell apoptosis was detected with flow cytometry. [Result] Different concentrations of the total flavonoids and the total polysaccharides were cytotoxic to cells in a time and dose dependent manner. The purified extracts of the total flavonoids could enhance apoptisis rate of the cells， and dose and apoptosia rate were positively correlated. [Conclusion] The anti-proliferative effect of purified extracts of the total flavonoids on the cells was stronger than the crude extract of the total flavonoids and the total polysaccharides. The mechanism may be related to the inhibition apoptisis rate of the cells.

Key words Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain； Colorectal cancer cells； anti-proliferation； Apoptisis rate of the cells；Antitumor

昆侖雪菊為菊科金雞菊屬（Coreopsis），是一年生草本植物的干燥頭狀花序，具有獨特功效的稀有高寒植物[1]。常飲雪菊茶，有神奇的降壓、降脂作用，且具有很好的清肝明目、益肝補陰、美容養(yǎng)顏、潤腸通便之特性，對用眼過度造成的視覺疲勞與飲酒造成的肝臟傷害等癥狀有一定的緩解作用[2]。國內(nèi)關于雪菊的體外抗腫瘤并未報道，國外的報道僅限于雪菊的單體對小鼠皮膚腫瘤抑制作用[3]。20世紀以來癌癥發(fā)病一直呈上升的趨勢，腫瘤現(xiàn)已成為嚴重威脅人類生命健康且較廣泛的疾病，腫瘤的防治也成為世界范圍內(nèi)廣泛重視的課題，不少國家已注意到使用傳統(tǒng)醫(yī)學方法進行防治，特別是對具有數(shù)千年歷史的中醫(yī)中藥非常關注[4]。因此該研究探討了昆侖雪菊總黃酮粗提取物、純化物及對結腸癌細胞株增殖的抑制作用以及對細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

儀器和試劑。CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；Benchmark PLUS型全波長酶標儀（美國BIORAD公司）；流式細胞儀（美國BECKMAN公司）；倒置熒光三目顯微鏡（美國CoolSNAP）；ZHJH1214C型超凈工作臺（中國上海智城有限公司）；TP114型電子天平（美國丹佛公司）；Br4i型低溫離心機（美國Jouan公司）；胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號141012）；二甲基亞砜（美國MP Biomedicals公司，批號M5178 ）；培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號AZG190856）；噻唑藍MTT（美國sigma公司，批號M5655）；凋亡檢測試劑盒（美國BD公司，批號3337788）；胰酶（美國Gibco公司，批號25200）。

1.1.2

腫瘤細胞。人結腸癌細胞（HCT116細胞、CACO2細胞）由新疆第一附屬醫(yī)院基礎醫(yī)學研究所阿爾孜古麗·吐爾遜老師惠贈。

1.1.3

藥材。昆侖雪菊為菊科金雞菊屬（Coreopsis）植物，于2013年6～9月在新疆和田地區(qū)昆侖山采集，經(jīng)新疆醫(yī)科大學藥學院天然藥物化學/生藥學教研室帕麗達·阿布力孜教授鑒定為菊科金雞菊品種。

1.1.3.1

昆侖雪菊總黃酮提取物。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀萃取30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總黃酮含量為22.56%。

1.1.3.2

總黃酮純化物。由雪菊總黃酮粗提物經(jīng)聚酰胺純化工藝獲得，總黃酮含量為68.04%。

1.1.3.3

昆侖雪菊總多糖。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，過三號篩，備用。稱取雪菊適量，1∶20投料比，加40 ml蒸餾水，浸泡1 h，利用超聲微波協(xié)同萃取儀，超聲30 min，過濾，濾液減壓濃縮得其浸膏，測定總多糖含量為24.74%。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養(yǎng)。將人結腸癌細胞接種于含10%滅活胚胎血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃飽和濕度及5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞長至培養(yǎng)瓶的80%進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.2.2

制備供試液。精密稱定雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亞砜（DMSO）溶解，并定容于10 ml容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為5 g/L的3種供試液，4 ℃冰箱保存，臨用前用培養(yǎng)液稀釋分別配制成不同濃度的3種供試液（DMSO體積分數(shù)低于0.1%）。

1.2.3

MTT法檢測樣品對結腸癌細胞增殖的抑制作用。將處于對數(shù)生長期HCT116細胞、CACO2細胞分別以3×104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，在37 ℃飽和濕度及5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h后，觀察其貼壁情況，將每孔的培養(yǎng)液取出后，加入系列濃度的待測樣品溶液。經(jīng)過初步的篩選后確定試驗組設6個藥物濃度組，每組藥物的最終濃度為50、100、200、400、600 μg/ml，對照組加入同樣濃度的DMSO，陽性對照組則為濃度為20 μg/ml的順鉑，每組4個孔，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)48、72、96 h，培養(yǎng)結束前4 h，每孔加MTT 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振蕩充分溶解結晶物后，用Model550多孔自動酶標儀比色（波長490 nm），測吸光度值，并按公式計算細胞生長抑制率，生長抑制率=（1-試驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%[5]。

1.2.4

流式細胞儀檢測細胞凋亡。取對數(shù)期HCT116細胞、CACO2細胞，以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，觀察其貼壁狀況，狀態(tài)良好時，分別加入100、200、400 μg/ml不同濃度的雪菊總黃酮純化物，并設立細胞對照組（不加藥物），再置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，把各孔的細胞培養(yǎng)液分別吸出到15 ml離心管中內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞，用胰酶將細胞消化收集結腸癌細胞，充分消化成單細胞懸浮液，細胞消化完成后，收集并放入離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，收集細胞，加入1 ml PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取含有1×106個細胞懸浮液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入100 μl binding buffer輕輕重懸細胞，接著分別加入5 μl Annexin VFITC和PI，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，再加入400 μl的binding buffer，隨即用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5

統(tǒng)計方法。試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 對結腸癌HCT116細胞增長的抑制作用

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于HCT116細胞，72 h后，觀察不同濃度的樣品對HCT116細胞增殖的影響。由表1可知，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對結腸癌HCT116細胞均有抑制作用，其IC50分別為421.68、69.21、815.68 μg/ml，隨著濃度的增加，細胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物對結腸癌HCT116細胞生長抑制影響呈劑量依賴性。通過各提取物的IC50比較，雪菊總黃酮的純化物對結腸癌HCT116細胞抑制作用強于總黃酮的粗提取物及總多糖。

從雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時不同提取物對HCT116細胞作用隨時間增長的關系（圖1）可看出，樣品濃度固定時，隨著樣品作用時間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對HCT116細胞增殖的抑制作用增強，呈現(xiàn)時間依賴性。

2.2 對結腸癌CACO2細胞增長的抑制作用

用濃度分別為50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于CACO2細胞，72 h后，觀察不同濃度的樣品對CACO2細胞增殖的影響。由表2可知，雪菊總黃酮粗提取物、純化物及總多糖對結腸癌CACO2細胞均有抑制作用，其IC50分別為227.25、155.82、505.30 μg/ml，隨著濃度的增加，細胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物對結腸癌CACO2細胞生長抑制影響呈劑量依賴性。通過各提取物的IC50比較，雪菊總黃酮的純化物對結腸癌CACO2細胞抑制作用強于總黃酮的粗提取物及總多糖。

由雪菊不同提取物濃度為200 μg/ml時不同提取物對CACO2細胞作用隨時間增長的關系（圖2）可見，樣品濃度固定時，隨著樣品作用時間的增加，雪菊總黃酮粗提物、純化物及總多糖對CACO2細胞增殖的抑制作用增強，呈現(xiàn)時間依賴性。

2.3 流式細胞儀檢測雪菊總黃酮純化物對細胞凋亡率的影響

流式細胞儀Annexin V-PI雙標法進行凋亡率的測定，結果表明（表3），100、200、400 μg/ml的雪菊總黃酮純化物作用HCT116、CACO2細胞72 h后，隨樣品濃度加大，活細胞比例逐漸減少，細胞凋亡發(fā)生率明顯增高。

3 結論與討論

結腸癌是世界死因順位中列第3位的腫瘤，盡管結腸癌的治療手段有很大進展，但多年來晚期結腸癌的5年生存率并無多大改觀。因此，結腸癌預防的意義愈顯重要。由于主流的治療癌癥的方法有很大的缺陷，世界科學家開始把抗腫瘤藥物研究的目光轉(zhuǎn)移到天然產(chǎn)物上，從不同的中草藥中提取抗腫瘤活性強的成分?？傸S酮具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗腫瘤活性等。

MTT法是一種檢測細胞功能的方法。細胞在活化增殖的過程中，線粒體的能量代謝能夠把MTT法代謝為藍紫色的甲臢，甲臢沉積于細胞內(nèi)或細胞周圍，通過二甲基亞砜溶解甲臢，用酶標儀檢測其吸光度值。靈敏度高、簡單，最常用于體外抗腫瘤藥物篩選的方法。該研究采用MTT法對雪菊總黃酮粗提取物、總黃酮純化物及總多糖進行體外對結腸癌細胞株抑制作用的研究，結果表明，雪菊總黃酮粗提物、總黃酮純化物及總多糖對結腸癌細胞株有抑制作用，其中雪菊總黃酮純化物抑制作用最強，從而進行雪菊總黃酮純化物誘導細胞凋亡試驗，采用流式細胞儀Annexin VPI雙標法進行凋亡率的測定，結果表明隨樣品濃度加大，活細胞比例逐漸減少，細胞凋亡發(fā)生率明顯增高。綜上所述，昆侖雪菊總黃酮純化物對結腸癌細胞株有很好的抑制作用，其機制可能與其誘導細胞有關。

參考文獻

[1] 張彥麗，王艷，李新霞，等.高效液相色譜法測定昆侖雪菊中綠原酸和黃芩苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（4）：107-109.

[2] 木合布力·阿布力孜，張燕，景兆均，等.新疆昆侖雪菊化學成分的初步定性研究[J].新疆醫(yī)科大學學報，2010，33（6）：628-630.

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[4] 杜崇民，劉春宇.黃酮類化合物抗腫瘤研究進展[J].中國野生植物資源，2007，26（3）：3-5.

[5] 王天山，陸躍鳴，馬國祥，等.鼓槌石斛中化學成分對K562腫瘤細胞株生長抑制作用體外實驗[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9（2）：1-3.