彭積貴　何昌進(jìn)

[摘要] 目的 探索一種肺癌染色體分析的有效方法。 方法 通過原代培養(yǎng)獲取肺癌單細(xì)胞，采用G顯帶染色，比較不同秋水仙素作用量和作用時(shí)間及不同低滲時(shí)間所獲取的染色體數(shù)量、形態(tài)及條帶情況。 結(jié)果 秋水仙素0.1 μg/ml作用100 min，低滲20 min獲得的染色體數(shù)量多、形態(tài)規(guī)則勻稱，條帶清晰。 結(jié)論 秋水仙素可用于肺癌核型分析及獲取肺癌染色體譜。

[關(guān)鍵詞] 秋水仙素；肺癌；染色體；核型分析；優(yōu)化

[中圖分類號(hào)] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2015）09（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate a effective method on the Colchicine in chromosome identification method in lung cancer. Methods Single cell was obtained from primary culture，the number，morphology and strip situation of lung chromosome with the different dosage and time of colchicine as well as different hypotonic time via uesing G—banding were compared. Results The chromosome with better quantity，regular morphology and clear bands was obtained in the group treated with 0.1 μg/ml Colchicine culturing 100 min and hypotonicing 20 min. Conclusion Colchicine can be used for karyotype analyses，and the chromosome in lung cancer is obtained.

[Key words] Colchicine；Lung；Chromosome；Karyotype analyses；Optimization

肺癌是全球高發(fā)惡性實(shí)體瘤之一，其發(fā)病率與死亡率均占惡性腫瘤首位。肺癌等實(shí)體瘤中廣泛存在染色體異常，染色體異常導(dǎo)致基因異常擴(kuò)增、表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)[1-3]。實(shí)體瘤的染色體不穩(wěn)定性研究可為腫瘤治療提供新的治療靶點(diǎn)，如淋巴瘤、慢性粒細(xì)胞白血病等血液病中特異染色體異常，為該病治療提供有效方法[4]，然而，實(shí)體瘤與血液腫瘤存在組織差異，導(dǎo)致其染色體分析更為復(fù)雜、困難。本文通過優(yōu)化實(shí)體瘤染色體分析相關(guān)影響因素對(duì)肺癌核型分析方法進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、人表皮生長(zhǎng)因子（human epidermal growth factor，hEGF）、氫化可的松、青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶，均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；膠原酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；分散酶購(gòu)自瑞士Roche公司，秋水仙素、Giemsa染料購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司。其他試劑均為分析純以上。

1.1.2 組織標(biāo)本 肺癌標(biāo)本取自2013年5月～2014年5月福建醫(yī)科大學(xué)附屬寧德市醫(yī)院新鮮手術(shù)標(biāo)本，術(shù)前未進(jìn)行放療和化療，術(shù)后均經(jīng)常規(guī)病理證實(shí)，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.1 原代培養(yǎng)

取新鮮肺癌手術(shù)組織，將組織塊剪碎，加入25 ml消化酶（0.1%Ⅱ型膠原酶、0.15%分散酶），37℃消化至組織塊消失，過濾離心2遍，加入培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行制片。

1.2 染色體制備

1.2.1 秋水仙素用量 取原代肺癌細(xì)胞A、B、C、D、E五組，每組分5份，實(shí)驗(yàn)前夜換液，次日分別加入濃度為20 μg/ml的秋水仙素30、40、50、60、70 μl，37℃培養(yǎng)120 min，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，低滲30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較秋水仙素不同濃度的作用效果。

1.2.2 秋水仙素作用時(shí)間 根據(jù)1.2.1所得最佳結(jié)果取原代肺癌細(xì)胞A、B、C、D、E五組，每組分5份加入秋素，37℃分別培養(yǎng)80、100、120、140、160 min，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，低滲30 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較秋水仙素不同培養(yǎng)時(shí)間的作用效果。

1.2.3 低滲時(shí)間 根據(jù)1.2.1和1.2.2所得最佳結(jié)果取原代肺癌細(xì)胞A、B、C、D、E五組，每組分5份加入秋水仙素培養(yǎng)，離心去上清液，分別加入0.075 mol/L氯化鉀溶液，分別低滲10、20、30、40、50 min，此后按1.2.4～1.2.6操作，比較不同低滲時(shí)間的作用效果。

1.2.4 固定 低滲后加入現(xiàn)配固定液（醇∶冰醋酸=3∶1）2 ml混勻，預(yù)固定5 min，1000 r/min離心10 min，去上清液，加固定液8 ml，重懸混勻后固定10 min，重復(fù)2遍，去上清液。

1.2.5 滴片、烤片 每管加入新鮮固定液0.5～1 ml混勻成細(xì)胞懸液，取1滴細(xì)胞懸液滴至預(yù)冷的-20℃載玻片中使細(xì)胞均勻散開，放置80℃烤箱烤片5～6 h。

1.2.6 染色 將烤好的載玻片放入37℃胰酶消化27 s，每張加入Giemsa染料2 ml，染色6 min，自來水沖洗去除染料，置濾紙上，室溫干燥。

1.2.7 鏡檢 每張片高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察并記錄分裂中期細(xì)胞數(shù)，油鏡下觀察染色體形態(tài)特征。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x±s表示，組間采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秋水仙素用量

原代肺癌細(xì)胞中加入不同濃度秋水仙素，在作用時(shí)間和低滲時(shí)間不變的情況下，秋水仙素濃度越高，染色體長(zhǎng)度越粗短（圖1），但獲得的分裂中期細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

2.2 秋水仙素作用時(shí)間

秋水仙素作用時(shí)間越長(zhǎng)，染色體長(zhǎng)度越粗短（圖3），且獲得的分裂中期細(xì)胞數(shù)相對(duì)增多，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖4）。

2.3 低滲時(shí)間

低滲時(shí)間短，獲得的分裂中期細(xì)胞數(shù)多，染色體易疊加成團(tuán)，低滲時(shí)間長(zhǎng)，獲得的細(xì)胞數(shù)少，染色體易分散，40 min和50 min組與10、20、30 min組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）；原代肺癌細(xì)胞中加入秋水仙素50 μl培養(yǎng)100 min，低滲20 min，獲得的染色分散均勻，長(zhǎng)度適中，形態(tài)規(guī)則，條帶清晰，有利于染色體觀察分析（圖6）。

3 討論

細(xì)胞核型鑒定臨床上多見于血液腫瘤及先天性遺傳病，明確細(xì)胞核型對(duì)指導(dǎo)血液腫瘤的治療及評(píng)估預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義。Grigorova等[5]通過細(xì)胞系培養(yǎng)核型分析發(fā)現(xiàn)肺癌等實(shí)體瘤中也存在大量的染色體變異，且不同的核型變化對(duì)臨床肺癌治療具有一定的指導(dǎo)意義。此外，多項(xiàng)研究表明，肺癌染色體形態(tài)多形性對(duì)預(yù)后具有指導(dǎo)性意義[6-7]。然而，由于實(shí)體瘤組織呈團(tuán)塊狀，癌灶中細(xì)胞周期存在明顯差異，且需將組織塊消化成單細(xì)胞，這些特性將影響秋水仙素的作用量和時(shí)間及細(xì)胞低滲時(shí)間等，因此實(shí)體瘤核型鑒定需對(duì)秋水仙素等影響因素進(jìn)行優(yōu)化。秋水仙素具有抑制細(xì)胞分裂前期紡錘絲的形成，使細(xì)胞分裂停留在中期，以積累大量的中期細(xì)胞的功能[8-10]。然而秋水仙素對(duì)細(xì)胞具有一定毒性，分裂中期染色體形態(tài)隨秋水仙素的量及作用時(shí)間變化而發(fā)生改變，嚴(yán)格掌握秋水仙素作用時(shí)間和量是染色體制片成功的關(guān)鍵[11-13]。秋水仙素的濃度和培養(yǎng)時(shí)間只有精確到最小濃度和最佳時(shí)間，才能收集到中期棒狀的染色體，濃度過大產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，染色體快速凝縮，使分裂相減少和染色體臂短粗，表面毛糙，邊緣不齊，明暗帶紋顯示不清，影響G顯帶制作效果，若阻斷培養(yǎng)時(shí)間超時(shí)，中期染色體在秋水仙素的作用下逐漸凝縮，染色體丟失，制片失敗[14-15]。本文采用細(xì)胞原代培養(yǎng)法獲取原代肺癌細(xì)胞，通過比較不同秋水仙素濃度及作用時(shí)間發(fā)現(xiàn)，0.1 μg/ml（50 μl）秋水仙素作用100 min，染色體大小長(zhǎng)短適中，形態(tài)規(guī)則，適合G顯帶及觀察。低滲時(shí)間是另一個(gè)染色體制片的重要影響因素，低滲時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞膜易破裂獲得細(xì)胞數(shù)少，且原代肺癌細(xì)胞經(jīng)消化后細(xì)胞膜損傷更易發(fā)生破裂，若低滲時(shí)間短，細(xì)胞膨脹不充分，滴片后包漿不易分散，背影雜質(zhì)多，且染色體易疊加成團(tuán)，影響核型分析。有研究證實(shí)，通過不同時(shí)間的低滲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低滲時(shí)間20～30 min染色體分散良好，包漿去除完全[16-18]。本文通過比較10～50 min 5組低滲時(shí)間所獲得的中期細(xì)胞數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低滲40 min后細(xì)胞膜破裂數(shù)明顯增多，高倍鏡下中期細(xì)胞數(shù)減少，低滲20 min染色體分散均勻，染色體間距適中，不易發(fā)生染色體丟失。

細(xì)胞核型制片過程中存在許多影響因素，除上述秋水仙素和細(xì)胞低滲外，空氣干濕度對(duì)烤片時(shí)間長(zhǎng)短也有影響，空氣濕度大則烤片時(shí)間需加長(zhǎng)，烤片后胰酶消化需嚴(yán)格秒表控制時(shí)間，否則將影響最后染色效果。制片過程中操作應(yīng)輕柔，特別低滲重懸時(shí)，若力量過大細(xì)胞易破裂導(dǎo)致染色體丟失。因此，染色體制片是一個(gè)要求嚴(yán)格而精確的過程，掌握每個(gè)操作環(huán)節(jié)要求和規(guī)范對(duì)獲得完整細(xì)胞核型進(jìn)行分析至關(guān)重要。

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（收稿日期：2015-04-09 本文編輯：王紅雙）