王玉華，蔡春友，李衛(wèi)東，韓鴻玲

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腎臟科，天津300052）

隨著人們生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變和體力勞動(dòng)的減少，糖尿病發(fā)病率與日俱增。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）統(tǒng)計(jì)，2011年全球糖尿病患者數(shù)為3.66億，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到5.52億。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是以糖代謝異常為主要原因所致的腎小球硬化并伴尿蛋白含量異常，是糖尿病的嚴(yán)重微血管并發(fā)癥，亦是糖尿病患者的主要死亡原因之一，在我國糖尿病腎病已經(jīng)成為導(dǎo)致終末期腎病的第二大原因，有資料表明每年新發(fā)的終末期腎病中DN占40%[1]。盡管以往研究認(rèn)為糖尿病病程長和控制不良是DN的重要危險(xiǎn)因素，但近來大量資料表明遺傳因素在DN的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2-3]，因此關(guān)于2型糖尿病腎病的遺傳學(xué)研究成為近年來研究的熱點(diǎn)。我們曾在1例無微量蛋白尿的早期DN患者的腎活檢組織中，發(fā)現(xiàn)有TGF-β1、TGF-βR1 和 Smad3 表達(dá)升高，目前該患者已發(fā)展為終末期腎病。為研究該患者DN早期TGF-β途徑激活的可能分子機(jī)制，進(jìn)一步探尋與2型糖尿病腎病的相關(guān)致病基因，了解DN的遺傳背景，我們對(duì)這例DN患者進(jìn)行了全外顯子測序。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 患者男性，年齡63歲，病程20年，1994年出現(xiàn)尿糖升高，行OGTT檢查確診為2型糖尿病，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年美國糖尿病協(xié)會(huì)公布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。2008年尿生化檢查尿蛋白升高，診斷為DN（DN診斷標(biāo)準(zhǔn)為：有糖尿病病史且尿微量白蛋白/肌酐>300mg/g，除外原發(fā)性腎小球病和其他繼發(fā)性腎小球疾?。?，在DN早期和中晚期兩次行腎活檢檢查，病理表現(xiàn)均為糖尿病腎損害，確診為糖尿病腎病，行眼底鏡檢查發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜病變，同時(shí)伴有周圍神經(jīng)病變。自2005年起采用胰島素治療，目前該患者已發(fā)展為終末期腎病，采用血液透析治療。本次研究調(diào)查和取樣均征得受試者同意并簽署了知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用高鹽法（北京百泰克生物技術(shù)公司，全血基因組DN提取試劑盒）提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，應(yīng)用Nanodrop2000/2000c分光光度計(jì)測定樣品DNA濃度及OD值（A260/280，A260/230），記錄樣品濃度和純度后-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 全基因組外顯子測序 采用AgilentSureSelect Human Kit芯片對(duì)DNA樣品進(jìn)行外顯子捕獲，樣品外顯子文庫建立后通過Hiseq2000高通量雙末端測序平臺(tái)進(jìn)行測序。輸出的原始數(shù)據(jù)（Reads）用SOAPaligner2.20與參考基因序列（NCBIbuid36.3，hg18）比對(duì)，通過 SOAPsnp（v1.03）得到外顯子及側(cè)翼區(qū)域SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 候選基因篩選 首先篩選出非同義突變（non-synonymous，NS）和剪切位點(diǎn)（splice acceptor and donor，SS）突變，將這些可能引起功能改變的突變（NS/SS）和公共數(shù)據(jù)庫 YH、dbSNP129、8HapMap外顯子組、千人基因組計(jì)劃進(jìn)行逐步對(duì)比過濾，篩除已報(bào)道的基因多態(tài)性位點(diǎn)。由于無義突變對(duì)基因功能的影響更加明顯，所以選出無義突變進(jìn)行基因功能分析。

1.2.4 免疫組化 采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（streptavidin/peroxidase，SP）法對(duì)患者腎活檢組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，研究基因FUT6（Abcam）的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 外顯子測序結(jié)果 利用Hiseq2000新一代高通量雙末端測序平臺(tái)，對(duì)1例病理確診的糖尿病腎病患者的全基因組外顯子進(jìn)行NS/SS突變分析，得到外顯子及側(cè)翼區(qū)域SNP數(shù)據(jù)庫，見表1。

表1 樣本外顯子SNP檢測結(jié)果Tab1 Summary of SNPs for exom e capture sample

2.2 外顯子濾過結(jié)果 在測序結(jié)果中選出患者的NS和SS這些突變相比同義突變和非編碼區(qū)突變對(duì)基因功能的影響更為顯著。NS/SS突變經(jīng)過公共數(shù)據(jù)庫YH、dbSNP129、8HapMap外顯子組和千人基因組外顯子組數(shù)據(jù)逐步過濾，排除多態(tài)性，最后發(fā)現(xiàn)有509個(gè)突變不存在于這些數(shù)據(jù)庫中（表2），其中包括497個(gè)錯(cuò)義突變和12個(gè)無義突變。對(duì)12個(gè)存在無義突變的基因（表3）在腎臟的表達(dá)情況進(jìn)行生物信息學(xué)分析（genome.ucsc.edu），發(fā)現(xiàn)在腎臟高表達(dá)的基因有ANKRD35、ACSM2A、FUT6和HAAO。

表2 突變?yōu)V過過程和結(jié)果Tab2 Variant prioritization pipeline

表3 樣本無義突變概況Tab3 Summary of nonsensemutations

2.3 免疫組化結(jié)果 考慮突變位點(diǎn)的Support、Score、expression和基因功能分析，選取FUT6基因進(jìn)行研究，免疫組化檢測FUT6基因在該患者腎臟的表達(dá)，可以明顯看出FUT6主要在腎小管表達(dá)，患者FUT6表達(dá)與正常人比較明顯下降（圖1）。

圖1 DN患者與正常人腎組織FUT6表達(dá)水平（×400）Fig1 Theexpression levelofFUT6in DNpatientsandnorm alperso n（×400）

3 討論

DN不僅是糖尿病患者的主要死亡原因，同樣也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因之一，大量資料表明遺傳因素在DN的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。隨著人類基因組計(jì)劃（Human genome project，HGP）和人類基因組單體型圖計(jì)劃（the international haplotypemap project，HapMap）的相繼完成，高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)個(gè)體全基因組或外顯子序列進(jìn)行測序，可獲得完整的全基因組或外顯子變異位點(diǎn)圖譜，研究與疾病相關(guān)的基因。目前多項(xiàng)研究顯示外顯子測序在孟德爾疾病的研究中取得了重大突破，證實(shí)外顯子測序發(fā)現(xiàn)孟德爾疾病的致病基因是有效和可行的[4-5]。

DN的確診有賴于腎組織病理學(xué)檢查，20世紀(jì)50年代以來，許多學(xué)者致力于DN病理結(jié)構(gòu)的研究，Tervaert等[6]在2010年將T1DN和T2DN的組織學(xué)改變進(jìn)行統(tǒng)一的病理分級(jí)，分別對(duì)腎小球、腎小管和腎血管損害進(jìn)行評(píng)估，但國際仍未形成統(tǒng)一的病理分級(jí)。目前臨床對(duì)DN的診斷和分級(jí)依據(jù)尿微量白蛋白，這與糖尿病合并腎臟疾病的患者很難區(qū)分，而糖尿病患者很少做腎活檢，所以目前臨床對(duì)DN的診斷并未十分明確。本研究以1例DN早期腎組織病理未見明顯異常但出現(xiàn)TGF-β1、TGF-βR1和Smad3的表達(dá)升高，經(jīng)臨床和病理分析確診的DN患者作為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行全基因組外顯子測序，以尋找與DN發(fā)病相關(guān)的致病基因，進(jìn)一步較為全面的了解DN的遺傳背景。

FUT6（巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶-6）基因定位于19p13.3，編碼α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的成員之一，催化巖藻糖基由GDP-α-L-Fuc轉(zhuǎn)移至糖鏈外側(cè)N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）3 位上的 FucT[7]，其主要的功能是合成Lewis系抗原（Lewisa和Lewisx）和唾液酸化的Lewis系相關(guān)抗原（sLewisa和sLewisx），在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[8-9]。本研究中，患者FUT6基因的堿基發(fā)生315TAC>TAA突變，使得氨基酸殘基由酪氨酸突變?yōu)榻K止密碼子，翻譯提前終止。Mollicone[10]在研究血清缺乏α-1，3－巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的印尼人家系時(shí)也發(fā)現(xiàn)了該突變位點(diǎn)的存在，證明了FUT6基因發(fā)生315Try>stop突變時(shí)，血清α－1，3－巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺乏，從而影響其功能。有研究報(bào)道缺乏糖基化修飾的TGF-βR2幾乎不與TGF-β1結(jié)合[11]，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制并不是十分明確，但Kim[12]用免疫熒光的方法證明TGF-βR2的糖基化修飾影響其在細(xì)胞表面的定位，從而影響與TGF-β1的結(jié)合，進(jìn)而影響其功能，這說明TGF-βR2的糖基化修飾是TGF-β1致纖維化的必要條件。Hirakawa[13]在研究 α－1，3F UTs對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，用siRNA干擾FUT6和FUT3后TGF-βR1和TGF-βR2的巖藻糖基化修飾明顯減少，Western blot發(fā)現(xiàn) E-cadherin、pHSP27 和 pP38的表達(dá)明顯下降，曾有報(bào)道E-cadherin[14]和pP38[15]在TGF-β介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）中有重要作用，EMT 是腎臟纖維化的重要過程[16]，由此可以認(rèn)為FUT6對(duì)TGF-βRs的巖藻糖基化修飾可能在腎間質(zhì)纖維化過程中起到重要作用。

目前沒有發(fā)現(xiàn)DN遵循一種明確的孟德爾遺傳模式，認(rèn)為是多種遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。本次研究對(duì)一早期還未出現(xiàn)腎臟功能性改變，但免疫組化證實(shí)有TGF-β、TGF-βR1和Smad3高表達(dá)的DN患者的全外顯子進(jìn)行測序，結(jié)合基因功能學(xué)分析發(fā)現(xiàn)基因FUT6的終止突變，免疫組化證實(shí)在該患者的腎活檢標(biāo)本中FUT6的表達(dá)下降。但目前尚缺乏直接證據(jù)表明FUT6終止突變與早期出現(xiàn)的TGF-β/Smad信號(hào)通路的激活有直接的聯(lián)系，需要進(jìn)一步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)其致病的具體機(jī)制進(jìn)行研究。另外候選致病基因還需進(jìn)行相關(guān)病例疾病驗(yàn)證和種系突變檢測，以明確其在該疾病中的發(fā)生率。

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