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天津漢族群體DYS19、DYS390和DYS393 STR基因座遺傳多態(tài)性的研究

2015-10-22 02:38:28史云芳李曉洲姚靜怡謝曉媛劉殿芹楊曉惠周佳妍
關(guān)鍵詞:整倍體基因座等位基因

琚 端,史云芳,李曉洲,李 巖,辛 力,姚靜怡,謝曉媛,劉殿芹,楊曉惠,周佳妍,張 穎

(1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,天津300052;2.天津市婦女兒童保健中心,天津300074;3.天津醫(yī)科大學(xué)影像學(xué)院,天津300203)

我國是出生缺陷高發(fā)國家,出生缺陷逐漸成為影響兒童健康和出生人口素質(zhì)的重大公共衛(wèi)生問題。染色體非整倍體異常是導(dǎo)致出生缺陷最常見的原因。盡管染色體核型分析是診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn),但因其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、技術(shù)要求高,不能滿足日益增長(zhǎng)的產(chǎn)前診斷需要。短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat,STR)又稱微衛(wèi)星DNA,是一種廣泛存在于人類基因組中,以2~6個(gè)堿基為單位,具有長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA序列。Y-STR在減數(shù)分裂過程中不發(fā)生重組,具有穩(wěn)定的單倍體父系遺傳特征,被廣泛用于個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定、群體遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域。近年來,定量熒光PCR(QF-PCR)擴(kuò)增STR基因座已在許多歐洲國家被應(yīng)用于產(chǎn)前診斷染色體非整倍體的檢測(cè)[1-2]。STR基因座具有顯著的人種和地域分布差異,因此國際遺傳學(xué)DNA委員會(huì)倡導(dǎo)建立各地區(qū)各種族的群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)[3-4]。筆者對(duì)天津漢族男性群體Y染色體上DYS19、DYS390和DYS393 3個(gè)STR基因座的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了研究,為天津地區(qū)性染色體異常的基因診斷和產(chǎn)前診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集200例籍貫為天津、三代居住在天津且無親緣關(guān)系的漢族男性個(gè)體外周靜脈血2 mL,EDTA抗凝,-20℃保存。所有樣本經(jīng)染色體核型分析結(jié)果正常。

1.2 DNA的提取 采用全血基因組DNA提取試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司),實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 引物選擇 根據(jù)NCBIUniSTS數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists),確定基因座的引物序列,正向引物5’端均由熒光染料5-羧基熒光素標(biāo)記,引物均由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基本特征及引物序列見表1。

1.4 QF-PCR擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板,在GeneAmp PCR system 9600擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增體系:d NTPs 1μL,10×PCR buffer 2.5μL、模板 DNA 2μL、上游引物 0.5μL、下游引物0.5μL,Taq DNA聚合酶0.5μL,ddH2O18 μL,總體積為25μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性95℃5 min、變性 95℃30 s、退火 52℃30 s、延伸 72℃30 s,35個(gè)循環(huán),最后72℃10min,4℃保存。

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè),ABIPrism GeneMapper v3.0軟件分析數(shù)據(jù),得出片段大小,整理結(jié)果。

1.6 測(cè)序及命名 3個(gè)基因座分別選擇兩個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序,根據(jù)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行命名。測(cè)序由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用直接計(jì)算法計(jì)算各等位基因頻率,基因多樣性(GD)采用公式 GD=n(1-ΣPi2)/(n-1)計(jì)算,其中Pi為等位基因頻率,n為樣本數(shù)。單倍型多樣性(HD)用公式HD=n(1-ΣHPi2)/(n-1)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 DYS19、DYS390和DYS393基因座測(cè)序結(jié)果DYS19基因座測(cè)序185 bp、201 bp兩個(gè)片段,重復(fù)序列為TAGA,分別重復(fù)7、11次,將其命名為7、11。DYS390基因座測(cè)序208 bp、224 bp兩個(gè)片段,重復(fù)序列為TCTA,分別重復(fù)9、13次,將其分別命名為9、13。DYS393 基因座測(cè)序 117 bp、121 bp 兩個(gè)片段,重復(fù)序列為TATC,分別重復(fù)12、13次,將其分別命名為12、13。

2.2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因頻率及單倍型頻率 200例漢族男性樣本均擴(kuò)增成功,其中DYS19基因座共發(fā)現(xiàn)5個(gè)等位基因。等位基因頻率在0.070 0~0.377 5之間。DYS390基因座共發(fā)現(xiàn)6個(gè)等位基因。等位基因頻率在0.005 0~0.390 0之間。DYS393基因座共發(fā)現(xiàn)6個(gè)等位基因。等位基因頻率在0.005 0~0.540 0之間。3個(gè)基因座的GD值分別為0.743、0.731及0.634。在本文調(diào)查的200例天津男性中,3個(gè)基因座共發(fā)現(xiàn)63種單倍型,其中最多見的單倍型為 8-11-12(0.075),在 15 個(gè)個(gè)體中出現(xiàn),單倍型多樣性為 0.706 8。DYS19、DYS390和DYS393基因座的基因頻率見表2。

表2 DYS19、DYS390和DYS393基因座基因頻率Tab2 Gene frequenciesof DYS19、DYS390 and DYS393

3 討論

《中國出生缺陷防治報(bào)告(2012)》指出,我國出生缺陷發(fā)生率為5.6%左右,每年新增出生缺陷兒約為90萬例。染色體非整倍體異常是導(dǎo)致出生缺陷最常見的原因。常見的異常包括21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、克氏綜合征(47,XXY)、Turner綜合征 (45,X)、Jacobs綜合征(47,XXX)以及超雄綜合征(47,XYY),約占產(chǎn)前診斷臨床有意義染色體異常的80%[5]。目前診斷及產(chǎn)前診斷染色體病的金標(biāo)準(zhǔn)是染色體核型分析,但該方法對(duì)技術(shù)要求高、分析培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng),有培養(yǎng)失敗的可能,一旦培養(yǎng)失敗不但會(huì)造成孕婦及家屬較重的精神負(fù)擔(dān)并且會(huì)延誤最佳處理時(shí)機(jī)。

QF-PCR技術(shù)是一種利用熒光引物對(duì)染色體上特異性STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,通過熒光檢測(cè)染色體拷貝數(shù)異常并做出快速產(chǎn)前診斷的方法。因具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速、自動(dòng)化、高通量等優(yōu)點(diǎn),一些歐洲產(chǎn)前診斷中心已常規(guī)將13、18、21、X以及Y染色體的STR基因座用于染色體非整倍體的診斷和產(chǎn)前診斷[1-2]。Plaseski等[6]利用多重QF-PCR方法通過擴(kuò)增X-STR基因座、SRY基因、Y-STR基因座DYS448和AZF相關(guān)基因等聯(lián)合檢測(cè)男性不育的遺傳性原因,包括染色體異常和Y染色體微小缺失等。

STR最早于真核生物基因組中被發(fā)現(xiàn)[7],因其核心序列的重復(fù)次數(shù)存在個(gè)體差異,故多數(shù)STR基因座具有高度多態(tài)性。1976年Cooke[8]首先報(bào)道了存在于Y染色體上的STR,之后越來越多的Y染色體STR基因座被開發(fā)并利用。與常染色體STR基因座分型相比,Y染色體上的基因座無需進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn),只需要單倍型分析即可,應(yīng)用方便。聯(lián)合多個(gè)STR復(fù)合擴(kuò)增可極大程度降低偶合概率,提高個(gè)體識(shí)別率。男性群體STR基因座的研究表明,Y-STR基因座多態(tài)性的分布具有明顯的種族、地域差異性。在不同人群甚至關(guān)系相近的人群中,其基因頻率分布均不同[9-10]。因此,建立當(dāng)?shù)氐牡任换蝾l率和基因型分布資料是利用YSTR進(jìn)行快速產(chǎn)前診斷的前提和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

目前,人類基因組數(shù)據(jù)庫中可供人類遺傳學(xué)研究的Y染色體遺傳標(biāo)記有200多個(gè),其中DYS19、DYS385a/b、DYS389…、DYS389…、DYS390、DYS391、DYS392和DYS393是歐洲Y染色體分型學(xué)會(huì)建立的“最小單體型”中最常用的一組多態(tài)性位點(diǎn)[11]。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了常用的易于擴(kuò)增、結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性較高的3個(gè)基因座DYS19、DYS390和DYS393進(jìn)行研究。結(jié)果顯示DYS19、DYS390和DYS393 3個(gè)基因座分別發(fā)現(xiàn)5、6、6個(gè)等位基因,基因頻率分別在0.070 0~0.377 5、0.005 0~0.390 0、0.005 0~0.540 0 之間,3個(gè)基因座的基因多樣性分別為0.743、0.731、0.634。200例樣本中共檢出63種單倍型,單倍型多樣性為0.706 8。一般來說,STR多態(tài)信息量大于0.5,表明遺傳標(biāo)記可提供高度的遺傳信息[12]。結(jié)果顯示,這3個(gè)基因座構(gòu)成的單倍型多態(tài)性信息含量較高,具有較高的個(gè)體識(shí)別率,可提供高度的遺傳信息。目前試劑盒中基因座的選擇主要基于歐洲、非洲等人群中各個(gè)Y-STR的基因座個(gè)體識(shí)別能力的考慮[13]。然而研究表明不同群體、不同地域關(guān)于Y-STR基因座的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)相比有一定的差異[14]。張玉紅等[15]對(duì)342例南通漢族無血緣關(guān)系男性個(gè)體的16個(gè)Y染色體STR基因座進(jìn)行研究,DYS19、DYS390和DYS393 3個(gè)基因座分別發(fā)現(xiàn)6、6、6個(gè)等位基因,GD分別為0.904 2、0.642 6、0.635 7。宋興勃等[16]研究 111 名成都地區(qū)漢族群體17個(gè)Y-STR基因座多態(tài)性分布,3個(gè)基因座分別發(fā)現(xiàn)6、6、5個(gè)等位基因,GD分別為0.669 3、0.651 4、0.650 3。Brown[17]在研究中提到所有利用QF-PCR進(jìn)行染色體非整倍體產(chǎn)前診斷的實(shí)驗(yàn)室都該建立自己獨(dú)立有效的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究通過對(duì)來本院進(jìn)行優(yōu)生咨詢的無親緣關(guān)系漢族男性3個(gè)Y-STR遺傳多態(tài)性的研究,建立了本地區(qū)、本實(shí)驗(yàn)室的人群數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和適合本地區(qū)人群的反應(yīng)體系,為性染色體數(shù)目異常的基因診斷及產(chǎn)前基因診斷提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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