魏會宇,金媛媛,王梅燕,朱立勤，3

(1.天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院藥劑科，天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院，天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所，天津300384；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070；3.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，天津300192）

蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2（s rchomology 2 domain containing phosphotyrosine phosphatase 2）是一種由蛋白酪氨酸磷酸酶N11（PTPN11）基因編碼的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPase），其分子結(jié)構(gòu)由兩個 Src同源區(qū)（N－SH2和C－SH2）、一個具有蛋白酪氨酸磷酸酶催化活性功能域和一個包含多個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)及一個富含脯氨酸Motif的C端尾巴組成[1]。SHP-2屬于蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員之一，作為細(xì)胞因子、生長因子及其它胞外刺激因素的下游信號分子，表達(dá)于機(jī)體的各種組織和細(xì)胞中，與許多重要的細(xì)胞生命活動（如細(xì)胞增殖、分化、移動、死亡的調(diào)控）密切相關(guān)[2-3]。近年來的系列研究發(fā)現(xiàn)，由PTPN11基因突變產(chǎn)生的SHP-2突變體與幼年型兒童粒單細(xì)胞白血病及其它類型白血病發(fā)病有關(guān)，SHP-2異常活化參與成年人白血病細(xì)胞惡性增殖病理過程，很可能是一個新的抗白血病藥物靶分子[4-5]。近年來，大量新型SHP-2抑制劑被報(bào)道出來[6-11]，這為進(jìn)一步研究SHP-2抑制劑的結(jié)構(gòu)特征，確定其結(jié)構(gòu)中對活性起關(guān)鍵性作用的藥效團(tuán)以及設(shè)計(jì)、搜尋新型SHP-2抑制劑打下了基礎(chǔ)。本研究采用Discovery Studio 3.5中的藥效團(tuán)模塊構(gòu)建SHP-2抑制劑的三維藥效團(tuán)模型，用于指導(dǎo)下一步新型結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)物的搜尋。

1 材料與方法

1.1 藥效團(tuán)模型構(gòu)建 計(jì)算工作所用軟件為Accelrys公司的Discovery Studio 3.5商用軟件包，所用參數(shù)設(shè)定除特別指明外均為默認(rèn)值。所有計(jì)算均在Linux操作系統(tǒng)中完成。從文獻(xiàn)[6-7,12-13]報(bào)道中選擇用于構(gòu)建基于配體分子共同特征三維藥效團(tuán)模型的訓(xùn)練集分子(圖1)。定義活性最好分子的Principal值為2，其余均為1，而活性最好的分子的Max Omit Feat值定義為0，其余均為1。采用featuremapping模塊選擇以下化學(xué)特征進(jìn)行藥效團(tuán)模型構(gòu)建：氫鍵供體(HBD)、氫鍵受體(HBA)、疏水中心(HY)、芳環(huán)中心(RA)以及負(fù)電中心(NI)。

圖1 SHP-2抑制劑訓(xùn)練集化合物分子結(jié)構(gòu)及其抑制活性Fig1 ThestructuresandactivitiesofSHP-2inhibitorsfor trainingset

用于構(gòu)建基于受體-配體晶體復(fù)合物藥效團(tuán)模型的SHP-2復(fù)合物（PDB ID：3O5X）是從Protein Data Bank（PDB）數(shù)據(jù)庫中獲取的。首先，對蛋白分子進(jìn)行加氫去水等準(zhǔn)備工作，然后利用DS的Receptor-ligand pharmacophore generation模塊產(chǎn)生藥效團(tuán)，并用其自帶的驗(yàn)證工具Validation驗(yàn)證模型的可靠性。

1.2 虛擬篩選 本次虛擬篩選選用公共免費(fèi)庫ZINC數(shù)據(jù)庫(2013年)。由于ZINC數(shù)據(jù)庫中化合物的數(shù)量非常龐大，因此本實(shí)驗(yàn)只篩選了其中的一部分大約1 600萬個分子。首先以HipHop算法產(chǎn)生的藥效團(tuán)模型為提問結(jié)構(gòu)，對ZINC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索,對匹配藥效團(tuán)特征的化合物進(jìn)行基于匹配值 fit value的排序,保留其中得分最高的一部分小分子化合物，再以CBP算法產(chǎn)生的藥效團(tuán)模型為提問結(jié)構(gòu),對被保留下來的化合物進(jìn)行匹配，最終得到同時符合兩種藥效團(tuán)特征的優(yōu)選化合物。

1.3 ADME預(yù)測 Schrodinger Suite 2009軟件中的QikProp模塊可以預(yù)測化合物的吸收、分布、代謝、排泄性質(zhì)。在QikProp模塊中，分子自動成中性狀態(tài)。在正常模式下，此模塊可以分析油水分配系數(shù)，水溶性，毒性。本實(shí)驗(yàn)對 logPo/w、PSA、logS、PMDCK進(jìn)行預(yù)測。PSA指極化表面積，與膜滲透相關(guān)的另一個參數(shù)；logPo/w指油水分布系數(shù)，改變藥物的油水分布系數(shù)達(dá)到提高其生物利用度的目的；logS指水溶性，改變藥物的水溶性提高藥物在血液中轉(zhuǎn)運(yùn)速度；PMDCK指狗腎細(xì)胞培養(yǎng)，與腸通透性有關(guān)的參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 基于配體分子共同特征的藥效團(tuán)模型結(jié)果HipHop算法的計(jì)算結(jié)果一共產(chǎn)生了10個藥效團(tuán)模型，這10個藥效團(tuán)模型的結(jié)果參數(shù)見表1。

表1 10個基于分子共同特征的藥效圖的結(jié)果參數(shù)Tab1 Theparametersof ten common featuresof pharmacophore

2.2 基于受體配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的藥效團(tuán)模型結(jié)果 CBP算法的計(jì)算結(jié)果一共產(chǎn)生了6個藥效團(tuán)模型，這6個藥效團(tuán)模型的結(jié)果參數(shù)見表2。

表2 基于受體配體復(fù)合物的藥效團(tuán)結(jié)果Tab2 The resultsof com plex-based pharm acophore

2.3 藥效團(tuán)的驗(yàn)證 ROC分析可用于檢驗(yàn)一個藥效團(tuán)模型是否具有從一系列非活性分子中挑選出活性分子的能力。本實(shí)驗(yàn)選取了47個已報(bào)道的SHP-2的小分子抑制劑作為活性分子，并在ZINC數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選取了987個小分子化合物作為非活性分子，分別導(dǎo)入到Pharmacophore Generation模塊Validation部分的Active Ligands和Inactive Ligands中，用于藥效團(tuán)模型的驗(yàn)證。兩種方法產(chǎn)生的藥效團(tuán)模型的驗(yàn)證結(jié)果分別顯示在表3、4中。

表3 基于配體共同特征的10個藥效團(tuán)模型的ROC分析結(jié)果Tab3 TheROC resu ltsof 10 comm on featuresof pharm acophore

表4 基于受體配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的6個藥效團(tuán)模型的ROC分析結(jié)果Tab4 TheROC resu ltsof 6 com plex-based pharm acophore

敏感度與特異性兩數(shù)值分別表示模型對活性分子以及非活性分子的識別能力。兩量化指標(biāo)的具體定義如下：

兩者得分越高，說明模型區(qū)分活性與非活性化合物能力越強(qiáng)。需要綜合評估，具體可從ROC曲線判斷，如圖2。曲線下面積值代表最后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖中最上方描述的Accuracy即為曲線下面積，該值應(yīng)大于0.5，越大代表模型區(qū)分能力越強(qiáng)。綜合分析后，我們選取模型5作為基于配體共同特征方法產(chǎn)生的最優(yōu)藥效團(tuán)模型，其包括4個藥效團(tuán)元素：2個氫鍵受體（HBA）和2個芳環(huán)中心（RA）；選取模型1作為基于受體配體復(fù)合物結(jié)構(gòu)方法產(chǎn)生的最優(yōu)藥效團(tuán)模型，其包括3個藥效團(tuán)元素：1個負(fù)電中心（NI）、1個氫鍵受體（HBA）和1個疏水中心（HY）。

2.4 虛擬篩選結(jié)果 最終我們篩選得到35個小分子化合物（圖3），這些化合物和兩個藥效團(tuán)模型都能很好地匹配，很有可能具有SHP-2抑制活性，是潛在的SHP-2小分子抑制劑。選取篩選得到的35個化合物之一ZINC08683953分別與兩個藥效團(tuán)模型匹配示范如圖4所示。

圖2 Pharm acophore_05與Pharmacophore_01的ROC曲線圖Fig 2 The ROC curve of Pharm acophore_05 and Pharm acophore_01

圖3 藥效團(tuán)虛擬篩選結(jié)果Fig 3 The resultsof pharm acophore-based virtualscreening

圖4 先導(dǎo)物與藥效團(tuán)的匹配舉例Fig 4 The examples of lead com poundsmatching the pharm acophores

2.5 ADME預(yù)測結(jié)果 應(yīng)用Schrodinger2009軟件包中的QikProp模塊對35個新設(shè)計(jì)及6個已報(bào)道的SHP-2抑制劑與藥效相關(guān)的5個性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果如表5所示（新設(shè)計(jì)的化合物只選取了10個代表性的結(jié)構(gòu)）。與6個已報(bào)道的SHP-2抑制劑分子相比，新設(shè)計(jì)的化合物的 PSA、logPo/w、logS、PMDCK均在合理的范圍內(nèi)。

表5 ADME預(yù)測Tab5 Physiochem icaldescriptorscalculated by QP

3 討論

訓(xùn)練集分子選取的原則：輸入分子的結(jié)構(gòu)具有多樣性，從而能夠代表不同系列同系物的結(jié)構(gòu)特征；化合物數(shù)目在2～32個，6個左右比較理想；盡量選擇活性最強(qiáng)的化合物；選擇結(jié)構(gòu)剛性大的分子效果比柔性分子好。ADME預(yù)測結(jié)果顯示，已報(bào)道的6個化合物PMDCK偏低，而logS偏高，而本文中新設(shè)計(jì)化合物的PSA、logPo/w、logS、PMDCK均在合理的范圍內(nèi)。該結(jié)果表明已報(bào)道的這6個化合物腸吸收差且水溶性偏高，可能是由于這6個化合物中存在過多的親水性基團(tuán)（羥基、羧基、磺酸基）引起的，而筆者設(shè)計(jì)的部分化合物卻很好地改善了這方面的結(jié)構(gòu)缺陷。

本文從配體小分子的共同特征和受體-配體晶體復(fù)合物兩方面出發(fā)，成功構(gòu)建了藥效團(tuán)模型并進(jìn)行了數(shù)據(jù)庫搜索，得到同時符合兩種藥效團(tuán)特征的化合物。本文的創(chuàng)新之處在于以文獻(xiàn)報(bào)道的SHP-2小分子抑制劑和已知配體-受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，篩選得到理論上更具研究價值的潛在先導(dǎo)化合物，既避免了傳統(tǒng)的分子對接的隨意性，又避免了單純的基于配體的藥效團(tuán)模型篩選可能會產(chǎn)生的假陽性問題，為化合物的虛擬篩選研究提供了一種新的思路和方法。

[1]Poole AW,JonesM L.A SHPing tale:Perspectiveson the regulation of SHP-1 and SHP-2 tyrosine phosphatases by the C-terminal tail[J].Cell Signal,2005,17(11):1323

[2]Qu C K.The SHP-2 tyrosine phosphatase:signaling mechanisms and biological functions[J].CellRes,2000,10(4):279

[3]Zheng H,Alter S,Qu C K.SHP-2 tyrosine phosphatase in human diseases[J].Int JClin Exp Med,2009,2(1):17

[4]Chan G,Kalaitzidis D,Neel B G.The tyrosine phosphatase Shp2(PTPN11)in cancer[J].CancerMetastasisRev,2008,27(2):179

[5]Loh M L.Recentadvances in the pathogenesisand treatmentof juvenilemyelomonocytic leukaemia[J].Br JHaematol,2011,152(6):677

[6]StuibleM,Doody KM,Tremblay M L.PTP1B and TC-PTP:regulators of transformation and tumorigenesis[J].CancerMetastasis Rev，2008,27(2):215

[7]Lee JY,Kim JK,ChoM C,etal.Cytotoxic flavonoidsasagonistsof peroxisome proliferator-activated receptor on human cervical and prostate cancer cells[J].JNatProd,2010,73(7):1261

[8]Yu ZH,Chen L,Wu L,etal.Smallmolecule inhibitorsof SHP2 tyrosine phosphatase discovered by virtual screening[J].Bioorg Med Chem Lett,2011,21(14):4238

[9]Liu W,Yu B,Xu G,etal.Identification of cryptotanshinone as an inhibitor of oncogenic protein tyrosine phosphatase SHP2(PTPN11)[J].JMed Chem,2013,56(18):7212

[10]Yu B,LiuW,YuW M,etal.Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatmentof PTPN11-Associatedmalignancies[J].Mol Cancer Ther,2013,12(9):1738

[11]Duan Y Q,Ma Y,Wang X J,etal.Design potential selective inhibitors for treating cancer by targeting the Src homology 2(SH2)domain-containing phosphatase 2 (Shp2)with core hopping approach[J].Protein Pept Lett,2014,21(6):556

[12]BhattaraiBR,Shresthaa S,Ham SW,etal.2-O-Carboxymethylpyrogallol derivatives as PTP1B inhibitorswith antihyperglycemic activity[J].BioorgMed Chem Lett,2007,17(19):5357

[13]Shrestha S,Bhattarai B R,Chang K J,etal.Methylenedisalicylic acid derivatives:new PTP1B inhibitors that confer resistance to diet-induced obesity[J].BioorgMed Chem Lett,2007,17(10):2760