張臻，闕華發(fā)

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所，上海 200032

益氣化瘀法中藥對糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面TGF-β/ALK 5/Smad2/3通路的影響

張臻，闕華發(fā)

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所，上海 200032

目的：探討益氣化瘀法中藥對糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面轉化生長因子-β（TGF-β）/激活素受體樣激酶（ALK）5/ Smad蛋白2/3通路的影響。方法：將50只大鼠隨機分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組、糖尿病對照組、正常對照組。通過腹腔注射鏈脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全層皮膚缺損模型，運用Westernblot技術手段分別檢測各組肉芽增生期創(chuàng)面成纖維細胞ALK5/Smad2/3的表達水平。結果：糖尿病對照組ALK5表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組ALK5表達水平明顯低于糖尿病對照組（P＜0.05），其與益氣組、化瘀組、正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。糖尿病對照組smad2表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組smad2表達水平與各組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。糖尿病對照組smad3表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組smad3表達水平低于化瘀組（P＜0.05），明顯低于糖尿病對照組、益氣組（P＜0.01），高于正常對照組（P＜0.05）。結論：糖尿病創(chuàng)面難以愈合及瘢痕形成的機制可能與ALK5/Smad2/3通路有關，益氣化瘀中藥可能通過抑制ALK5/Smad2/3通路，加速創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。

糖尿??；潰瘍；益氣化瘀法；轉化生長因子-β（TGF-β）/激活素受體樣激酶（ALK）5/Smad蛋白2/3通路

筆者在應用益氣化瘀中藥治療糖尿病潰瘍取得顯著臨床療效的基礎上［1］，通過實驗研究已初步證實，創(chuàng)面轉化生長因子-β（TGF-β）1的低表達可能是糖尿病潰瘍難以愈合的原因之一，益氣化瘀法可以通過上調TGF-β1的表達水平，同時促進轉化生長因子-β受體Ⅰ（TGF-βRⅠ）的表達，并下調sm ad3、sm ad4的表達水平，從而提高創(chuàng)面愈合的速度和質量［2～5］。為進一步深入探討益氣化瘀法促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機制，本文研究了其對糖尿病大鼠肉芽增生期創(chuàng)面成纖維細胞TGF-β/激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALK）/Sm ad通路的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 益氣化瘀方由生黃芪、太子參、桃仁、地龍組成，劑量比例2.5∶2.5∶1∶1，人鼠等效劑量為11.61 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥2.5 g/m L。拆方益氣方由生黃芪、太子參等組成，人鼠等效劑量為6.75 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥1.5 g/m L。拆方化瘀方由桃仁，地龍等組成，人鼠等效劑量為4.86 g/kg，減壓濃縮至濃度為含生藥1 g/m L［3］。均由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院制劑室按水煎醇沉工藝制備成煎劑濃縮，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。ALK5一抗，Abcam公司產品（Ab155258）；Sm ad2一抗，Abcam公司產品（Ab33875）；Sm ad3一抗，Abcam公司產品（Ab40854）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔二抗，北京中山生物工程公司產品（ZB-2301）。

1.2 儀器 RM 2145切片機，Leica公司產品；IMS細胞圖像分析儀，上海申騰信息技術有限公司產品；MV-CP410攝像機，Panasonic公司產品；BH2顯微鏡，O lym pus公司產品。

1.3 動物分組及處理 3月齡雄性SPF級W istar大鼠，體重200～250 g，平均體重（224.13±13.77）g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供［許可證號碼：SCXK（滬）2012-0002］。將50只大鼠隨機取10只為正常對照組，其余40只大鼠復制糖尿病性模型，隨機取10只為糖尿病對照組，其余30只隨機分為益氣化瘀組、益氣組、化瘀組。糖尿病性模型鼠實驗前12 h禁食，定量飲水。實驗當日稱體重，尾靜脈采血和收集尿液，用血糖儀和試紙法分別測定基礎血糖和尿糖，然后以pH4.6、0.1mm ol/L的枸櫞酸鈉緩沖液溶解鏈脲佐菌素（STZ），配成1%溶液，以60 m g/kg體重單次腹腔內注射STZ溶液，48 h后動物血糖濃度＞16.65 mmol/L及尿糖為++++時，即成糖尿病鼠模型［6］。將所有大鼠麻醉后背部備皮，作直徑10 mm的圓形標記，在無菌條件下，用外科方法切除標記處全層皮膚，止血后用無菌紗布覆蓋，糖尿病性模型鼠即成糖尿病潰瘍模型。造模后每只大鼠連續(xù)4天后腿肌肉注射青霉素40萬單位。各組于創(chuàng)面造模后次日開始給藥，換藥前均以1/5000呋喃西林溶液清潔創(chuàng)面，外敷單層生理鹽水紗布；正常對照組、糖尿病對照組生理鹽水灌胃，每天1次；各用藥組，藥物灌胃，每天1次。10天后將大鼠麻醉處死，用眼科手術剪剪取全層肉芽組織，觀察各組組織病理學，并以植快培養(yǎng)法進行成纖維細胞培養(yǎng)，Westernblot法檢測 ALK5、sm ad2、sm ad3各指標水平變化。

1.4 Westernblot法檢測 每組隨機抽取8個標本作為實驗樣本，各樣品取25μg上樣，m arker取10μL上樣（上樣前按說明書進行預處理），將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，進行電泳。然后轉移至PVDF上，用5%脫脂奶粉封閉，分別與特異性的抗體進行孵育（稀釋濃度分別為ALK5，1∶500；sm ad2，1∶1000；sm ad3，1∶5000；GAPDH，1∶1500），充分洗滌后孵育HRP標記山羊抗兔二抗，ECL化學發(fā)光，顯影，掃描分析，測定蛋白表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，采用方差分析比較各組間ALK5、sm ad2、smad3表達水平的差異。

2 實驗結果

各組ALK5、Sm ad2、Sm ad3比較，見表1。糖尿病對照組ALK5表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組ALK5表達水平明顯低于糖尿病對照組（P＜0.05），其與益氣組、化瘀組、正常對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。糖尿病對照組sm ad2表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組sm ad2表達水平與各組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。糖尿病對照組sm ad3表達水平明顯高于正常對照組（P＜0.05）；益氣化瘀組sm ad3表達水平低于化瘀組（P＜0.05），明顯低于糖尿病對照組、益氣組（P＜0.01），高于正常對照組（P＜0.05）。

表1 各組ALK5、Smad2、Smad3比較±s）

表1 各組ALK5、Smad2、Smad3比較±s）

與正常對照組比較，①P＜0.05；與糖尿病對照組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與化瘀組比較，④P＜0.05；與益氣組比較，⑤P＜0.01

組別益氣化瘀組益氣組化瘀組糖尿病對照組正常對照組n 8 8 8 8 8 ALK5 4215.59±1194.82②5205.97±1327.38 4878.53±1239.51 6720.21±2137.36①3210.52±767.67 Smad2 2351.63±629.05 2597.17±997.99 2611.01±1201.05 3384.09±1609.57①2056.53±195.06 Smad3 4283.12±1286.48①③④⑤6222.98±1270.56 6037.45±1663.62 8478.76±2147.60①1203.67±772.35

3 討論

糖尿病潰瘍屬中醫(yī)學潰瘍、消渴等范疇。自20世紀60年代起，在傳承全國中醫(yī)外科大家顧伯華先生經驗的基礎上，筆者從中醫(yī)理論、文獻、臨床和基礎研究等方面，對中醫(yī)藥治療糖尿病潰瘍進行了系統(tǒng)、深入研究，取得了一系列豐碩的成果。提出糖尿病潰瘍病機演變的特點為“因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p”，其中“虛”、“瘀”是創(chuàng)面難以愈合的主因。根據《醫(yī)林改錯》所述“元氣既虛，必不能達于血管，血管無力，必停留而瘀”等中醫(yī)藥理論，建立“益氣化瘀法”貫穿疾病治療始終的新觀點，確立了“益氣化瘀法”的治療法則和系列方劑，形成了“益氣化瘀法治療糖尿病潰瘍”的學術思想體系，明顯提高了糖尿病潰瘍的臨床療效，同時一定程度上能緩解瘢痕形成，提高愈合質量［7］。

隨著近年來分子生物學等學科的發(fā)展，對糖尿病創(chuàng)面愈合機制及瘢痕形成的研究日趨深入。增生性瘢痕是臨床常見的病理性瘢痕，其病理基礎是以成纖維細胞為主的細胞成分的過度增殖和以膠原為主的細胞外基質的過度沉積。TGF-β是一種重要的血管形成因子，具有廣泛的生物學活性，在潰瘍創(chuàng)面組織中含量的變化對潰瘍發(fā)生、修復愈合發(fā)揮核心作用，同時TGF-β也是公認為最強的致纖維化因子，是影響瘢痕形成的關鍵因素［8～9］。TGF-β可能通過增加Ⅰ、Ⅲ型膠原（特別是Ⅰ型膠原）沉積，抑制膠原酶活性、促進纖維粘連蛋白（FN）表達等因素，促進細胞外基質沉積，導致組織纖維化，瘢痕形成［10］。Sm ads蛋白家族是細胞內特異轉導TGF-β調控信息的信號轉導分子，它們可將TGF-β信號直接從細胞膜轉入細胞核內，并激活靶基因的轉入［11～12］，目前已被公認為修復相關基因，與創(chuàng)面的愈合有密切的關系。ALK是TGF-β的Ⅰ型受體，與其配體結合傳導信號。Sm ad是TGF-β的胞漿遞質，參與TGF-β的信號傳導。最新研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β超家族信號傳導有2條通路：一條是TGF-β/ALK1/Sm ad1/5途徑，與新生血管形成有關；另一條是TGF-β/ALK5/Sm ad2/3途徑，拮抗ALK1信號通道，并與纖維化有關［13］。對動物臟器纖維化模型研究結果表明，采用小分子抑制劑抑制ALK5活性可降低臟器中纖維化基因表達和膠原沉積，減少纖維化程度。

實驗結果顯示，糖尿病對照組ALK5/Sm ad2/3明顯高于正常對照組，提示糖尿病性潰瘍難以愈合及瘢痕形成的原因可能與之有關。益氣化瘀組及其拆方組能不同程度的抑制ALK5/Sm ad2/3通路，且益氣化瘀組更優(yōu)于其拆方組。由此可以認為，抑制ALK5/Sm ad2/3通路可能是益氣化瘀中藥促進創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成的途徑之一，初步印證了“補虛生肌”“化瘀生肌”的學術理論。同時，益氣化瘀組更優(yōu)于拆方組更進一步說明，益氣法與化瘀法合用，能更大程度的逆轉“因虛致瘀”“瘀阻傷正”的致?lián)p病機，更體現(xiàn)中醫(yī)相須配伍的科學性。

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（責任編輯：駱歡歡）

Effects o f Chinese Herbs o f Rep lenishing Qi and Reso lving Stagnation on Pathw ays o f TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 o f Granu lation-p ro liferative Skin U lcers in Diabetic Rats

ZHANG Zhen，QUE Huafa

Objective：To explore the effect of Chinese herbs of replenishing qiand resolving stagnation on the pathw ays of TGF-β/ALK5/Sm ad2/3 of skin ulcers at granulation proliferative stage in diabetic rats.Methods：Fifty rats w ere random ly divided into five groups：replenishing qiand resolving stagnation（RQRS）group，replenishing qi（RQ）group，resolving stagnation（RS）group，diabetes control（DC）group，and norm al control（NC）group.Diabetes m odelw as induced by peritoneal injection of streptozotocin and skin ulcers w ere caused by surgery m ethod in rats.And then the expression of ALK5，Sm ad2 and Sm ad3 w as detected w ith the m ethod of W estern blotting.Results：The levels of ALK5/Sm ad3 of the DC group w ere higher than those of NC group.The levels of ALK5/Sm ad2/3 of all the m edication groups w ere low er than those in DC group，and those in RQRS group w ere low er than those in RQ and RS groups.Conclusion：The therapy of rep lenishing qiand resolving stagnation can accelerate the w ound healing and reduce the scar form ation probably bym odulating the pathw ays of TGF-β/ALK5/Smad2/3.

Diabetes mellitus；Ulcer；Therapy of rep lenishing qi and resolving stagnation；Pathw ays of TGF-β/ALK5/ Sm ad2/3

R587.2

A

0256-7415（2015）06-0270-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.127

2015-01-02

國家自然科學基金青年科學基金項目（81202698）；國家自然科學基金項目（81173266）；上海市海派中醫(yī)傳承研究項目（ZYSNXD-CC-APGC-JD002）

張臻（1977-），女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師，研究方向：中醫(yī)外科學。