施琬，黃惠珠，李鐘，胡旭光，韓彬

廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006

建立高尿酸血癥動物模型實驗研究

施琬，黃惠珠，李鐘，胡旭光，韓彬

廣東藥學院中藥學院，廣東 廣州 510006

目的：探討構(gòu)建科學、合理、穩(wěn)定的高尿酸血癥動物模型，為治療高尿酸血癥藥物藥效及機制研究奠定基礎。方法：采用次黃嘌呤、氧嗪酸鉀和乙胺丁醇三者聯(lián)合應用造模。模型Ⅰ組采用次黃嘌呤（25 g/kg）飼料喂養(yǎng)，乙胺丁醇（250mg/kg）灌胃并同時皮下注射氧嗪酸鉀（200mg/kg）；模型Ⅱ組灌胃給予腺嘌呤（100mg/kg）和乙胺丁醇（250mg/kg）。連續(xù)檢測大鼠血清中血尿酸水平，并進行腎臟組織病理學觀察，綜合評價其對腎臟的影響。結(jié)果：模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠連續(xù)給藥10天后，其血尿酸水平均明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型Ⅰ組在造模的第3、7天的給藥后3h血清尿酸值已明顯升高，12～24 h與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。造模后模型Ⅰ、Ⅱ組的尿素氮與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2組模型動物血清肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與空白對照組比較無差異。模型Ⅰ組腎小管-間質(zhì)病理損害程度積分均低于模型Ⅱ組（P＜0.05）。結(jié)論：兩種造模方法均能有效造模，模型Ⅰ組更適合于高尿酸血癥治療藥物藥效篩選及作用機制的研究。

高尿酸血癥；次黃嘌呤；氧嗪酸鉀；乙胺丁醇；動物模型；大鼠

痛風是由于長期嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄減少所引起的常見代謝性疾病，臨床上首先表現(xiàn)為高尿酸血癥，其診斷標準定義為血尿酸水平男性＞420μm ol/L，女性＞357μm ol/L，其主要臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的急性痛風性關(guān)節(jié)炎、慢性痛風性關(guān)節(jié)炎、痛風石、痛風性腎病，嚴重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，有些患者還可伴發(fā)高脂血癥、糖尿病、高血壓病及心腦血管?。?～2］。

復制大鼠持續(xù)性高尿酸血癥模型的意義主要是為了研究治療高尿酸血癥藥物的藥效和作用機制，現(xiàn)有造模方法雖可使大鼠血尿酸較快升高，但高尿酸水平維持時間較短，很難觀察到藥物降尿酸的全程作用以及用于作用機制的研究，且大部分實驗顯示大鼠腎臟損害出現(xiàn)早并且較重，與人類發(fā)病過程不符。故目前尚缺乏理想的大鼠持續(xù)性高尿酸血癥動物模型［3～4］，從而對該類藥物的研究帶來很大影響，故積極摸索造模方法具有重要意義。

目前，制作高尿酸血癥動物模型給藥類型主要有3種：①促進尿酸生成增多，如補充尿酸、酵母、腺嘌呤、次黃嘌呤；②抑制尿酸分解，如給予氧嗪酸鉀；③抑制尿酸排泄：如灌胃乙胺丁醇。本實驗擬采取含次黃嘌呤飼料喂飼、皮下注射氧嗪酸鉀和灌胃乙胺丁醇3種藥物聯(lián)合造模，與腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇造模做比較，觀察受試動物大鼠血清尿酸值的變化，以探討3種藥物作用下，復制大鼠高尿酸模型的可行性。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2013-0034。

1.2 試劑與儀器 鹽酸乙胺丁醇片（生產(chǎn)批號：130102），廣州白云山明興制藥有限公司；腺嘌呤（生產(chǎn)批號：ZXRYE-TP），梯希愛（上海）工業(yè)發(fā)展有限公司；次黃嘌呤（生產(chǎn)批號：ZY131028），上海紫一試劑廠；氧嗪酸鉀（生產(chǎn)批號：131015）瀚渤（上海）貿(mào)易有限公司；肌酐試劑盒（生產(chǎn)批號：20140108），谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（生產(chǎn)批號：20140106），尿素氮試劑盒（生產(chǎn)批號：20140108），尿酸試劑盒（生產(chǎn)批號：20131217），南京建成生物工程研究所；德國sigm a高速離心機；AMS-18自動生化分析儀，北京奧普森生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物配制 飼料制作：用打粉機將正常飼料粉碎成粉末后加入次黃嘌呤攪拌均勻，取出加入滅菌蒸餾水和好，用50 m L針筒擠出圓柱狀飼料。放入烘箱烘干至飼料中殘留水分揮發(fā)即可。鹽酸乙胺丁醇配制：將藥片壓碎，加蒸滅菌餾水溶解、混勻，配成25m g/m L。氧嗪酸鉀鹽配制：干粉研磨約至細粉后，滴加入橄欖油研磨，可保存2～3天。

2.2 動物分組及處理 將雄性SD大鼠30只隨機分為空白對照組、模型Ⅰ、Ⅱ組，共3組，每組10只。大鼠均單籠飼養(yǎng)。實驗前24 h開始喂飼飼料，模型Ⅰ組飼料中含次黃嘌呤25 g/kg，正常對照組和模型Ⅱ組給予正常飼料，連續(xù)喂飼。開始實驗前，記錄大鼠12 h的攝食量。模型Ⅰ組灌胃給予乙胺丁醇250m g/kg，給藥體積為10m L/kg，同時皮下注射氧嗪酸鉀200m g/kg，給藥體積為0.5m L/kg；模型Ⅱ組灌胃給予腺嘌呤100m g/kg和乙胺丁醇250m g/kg制備而成的混懸液，給藥體積為10m l/kg。連續(xù)10天。

2.3 血尿酸測定 造模前1天，于各組大鼠眼眶后靜脈叢取血置于1.5 m L離心管中，收集的血液樣品常溫放置3 h，4000 rpm/m in離心15m in，得血清。模型Ⅰ組于開始實驗的第3和7天皮下注射氧嗪酸鉀后的第3、6、12、24 h于大鼠眼眶后靜脈叢取血置于1.5m L離心管中，收集的血液樣品常溫放置3 h。4000 rpm/m in，半徑10 cm離心15m in，得血清。實驗第10天給藥后第6 h于各組大鼠眼眶后靜脈叢取血處死前采血置于5m L離心管中，所收集的血液樣品常溫放置3 h。4000 rpm/m in離心15m in，得血清。各批次血清樣本均使用自動生化分析儀測定血尿酸。

2.4 腎臟病理及損害程度的判斷 造模第10天給藥后6 h處死各組大鼠，沿腹中線逐層剪開腹膜，推開內(nèi)臟組織，找到腎臟，剪開腎包膜，觀察腎臟肉眼改變，組織標本置于10%中性福爾馬林緩沖液中保存固定48 h后，用石蠟包埋機常規(guī)包埋，行切片及HE染色。腎小管-間質(zhì)病理損害程度的判斷：每張切片隨機選取10個不重疊視野測定，計算病變面積與同視野腎皮質(zhì)總面積的百分比，按以下方法換算為分數(shù)后取平均值。腎小管間質(zhì)炎癥程度半定量評分法：0分，無炎癥細胞浸潤；1分，炎癥細胞浸潤＜25%；2分，炎癥細胞浸潤25%～49%；3分，炎癥細胞浸潤50%～75%；4分，炎癥細胞浸潤＞75%。腎小管病變的評分觀察指標包括以下2個方面：腎小管變性、壞死；腎小管擴張、萎縮。按病變程度與范圍進行半定量評分：0分，無小管病變；1分，病變小管面積＜10%；2分，病變小管面積10%～25%；3分，病變小管面積26%～75%；4分，病變小管面積＞75%。以上結(jié)果的判讀采用盲法進行，由2名與本實驗無關(guān)的病理研究員實施［5］。2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計，實驗數(shù)據(jù)以±s）表示，分級組間多重比較采用非參數(shù)秩和檢驗與秩變換分析方法。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組血尿酸值比較 見表1、表2。模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠連續(xù)給藥10天后，其血尿酸水平均明顯升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型Ⅰ組在造模的第3和7天的給藥后3 h血清尿酸值已明顯升高，到12 h時，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），到24 h時的尿酸值雖然下降，但亦高于空白對照組（P＜0.05）。

表1 各組造模前后血尿酸值比較±s） μmol/L

表1 各組造模前后血尿酸值比較±s） μmol/L

與空白對照組比較，①P＜0.05

組別空白對照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組n 8 8 8造模前95.63±7.09 100.63±8.58 98.25±9.24造模后96.63±12.49 381.75±61.75①235.25±24.20①

表2 2組造模第3和7天血尿酸值比較±s） μmol/L

表2 2組造模第3和7天血尿酸值比較±s） μmol/L

與空白對照組比較，①P＜0.05

采血時間點3 h 6 h 12 h 24 h空白對照組95.36±12.60 97.20±12.56 96.28±11.32 96.63±12.49模型Ⅰ組第3天485.13±116.60①531.63±188.03①402.25±84.47①159.38±54.40①第7天483.13±78.81①422.50±94.39①365.38±94.39①218.75±57.68①

3.2 各組尿素氮、肌酐、轉(zhuǎn)氨酶變化比較 見表3。造模后模型Ⅰ、Ⅱ組的尿素氮與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。2組模型動物血清肌酐和谷丙轉(zhuǎn)氨酶與空白對照組比較無差異。

表3 各組尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶變化比較±s）μmol/L

表3 各組尿素氮、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶變化比較±s）μmol/L

與空白對照組比較，①P＜0.05

組別空白對照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組n 8 8 8尿素氮3.04±0.51 6.2±0.72①8.14±2.1①肌酐54.5±15.59 59.5±6.95 60.38±15.55谷丙轉(zhuǎn)氨酶20.25±6.14 23.75±4.33 23.25±6.69

3.3 各組腎臟病理改變及損害程度比較 見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、表4、表5?？瞻讓φ战M大鼠腎單位結(jié)構(gòu)正常，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，上皮細胞排列整齊。髓質(zhì)集合管管腔規(guī)則。模型Ⅰ組腎小球病變不明顯，單位組織結(jié)構(gòu)完整，腎間質(zhì)小血管輕微充血，腎小管管腔呈不規(guī)則形，部分上皮細胞水腫，胞漿淡染。腎髓質(zhì)由大量密集平行排列的集合管組成，集合管管腔較大，披覆單層立方或柱狀上皮，核圓居中，胞漿染色淡，無明顯病變。模型Ⅱ組腎小球未見明顯病變，腎小管病變較嚴重，部分上皮細胞變扁平，部分腎小管內(nèi)可見炎細胞聚集，腎間質(zhì)水腫，伴中量炎細胞浸潤。腎髓質(zhì)集合管內(nèi)可見白細胞管型。模型Ⅰ組腎小管-間質(zhì)病理損害程度積分均低于模型Ⅱ組（P＜0.05）。

4 討論

大鼠高尿酸血癥模型的建立，自2001年熊湘明等［6］以灌胃腺嘌呤100m g/kg和乙胺丁醇250m g/kg取得成功后，該方法得到廣泛應用。而徐立等［7］以喂飼含次黃嘌呤50 g/kg的飼料和皮下注射尿酸酶抑制劑200m g/kg，陳光亮等［8］則以皮下注射氧嗪酸鉀200m g/kg和灌胃乙胺丁醇250m g/kg，也都成功建立。

高尿酸血癥的相對穩(wěn)定和維持一直是此類模型制作過程中的難點，既往研究表明，連續(xù)給予造模劑各組大鼠血清尿酸值變化與單次給予造模劑不同，后者僅可使受試動物血清尿酸值短暫升高，維持時間約12 h。而連續(xù)給予造模劑可使受試動物血清尿酸值持續(xù)升高，并可在給予造模劑時段內(nèi)始終維持在較高水平。根據(jù)既往報道，若一次性灌胃給予次黃嘌呤500m g/kg和尿酸酶抑制劑50m g/kg，大鼠血尿酸在造模后3、6、9 h均高于正常水平，但12 h后基本降至正常水平［9］；若每12 h給予次黃嘌呤500m g/kg灌胃，同時皮下注射尿酸酶抑制劑200m g/kg，大鼠血尿酸不斷升高，但出現(xiàn)了動物死亡，可能是尿酸沉積于腎組織導致腎臟嚴重損傷［10］。本實驗模型Ⅰ組采用尿酸前體物的次黃嘌呤、抑制尿酸排泄的乙胺丁醇和抑制尿酸酶活性的氧嗪酸鉀，三藥聯(lián)用造模，在造模的24 h內(nèi)，大鼠的血尿酸明顯高于正常值，但波動較大，特別是12 h以后，血尿酸值下降，但仍可維持在空白對照組的1倍以上，且無動物死亡。

圖1 空白對照組腎小管（×400）

圖2 空白對照組腎髓質(zhì)（×200）

圖3 模型Ⅰ組腎小管（×400）

圖4 模型Ⅰ組腎髓質(zhì)（×200）

圖5 模型Ⅱ組腎小管（×400）

圖6 模型Ⅱ組腎髓質(zhì)（×200）

表4 各組大鼠腎臟病理改變評分分級（n＝8）

表5 各組腎小管-間質(zhì)病理損害程度積分比較±s，n＝8）

表5 各組腎小管-間質(zhì)病理損害程度積分比較±s，n＝8）

與空白對照組比較，①P＜0.05；與模型Ⅱ組比較，②P＜0.05

組別空白對照組模型Ⅰ組模型Ⅱ組炎細胞浸潤0.00±0.00 1.40±0.55①②2.83±0.41①腎小管損傷0.00±0.00 2.20±0.45①②3.17±0.41①總積分0.00±0.00 3.60±0.89①②6.00±0.63①

次黃嘌呤為人體生成尿酸的前體物質(zhì)，加上皮下注射尿酸酶抑制劑抑制尿酸分解，乙胺丁醇抑制尿酸排泄，可使尿酸在體內(nèi)蓄積，從而增加血尿酸水平，并可以維持較長時間的高尿酸水平，如給予合理的劑量，可以造成長期高尿酸血癥的大鼠模型，但其中關(guān)鍵是給予次黃嘌呤的方法，若在藥效實驗時再增加灌胃給藥環(huán)節(jié)，則可能會增加動物的死亡率。

造模過程中對腎臟的影響也一直是需要特別關(guān)注的問題。既要考慮造模藥物自身對腎臟的作用，而過高的尿酸血癥本身也會引起急性尿酸性腎病。從圖5和圖6可以看到，模型Ⅱ組腎小管病變較嚴重，腎小球雖未見明顯病變，但尿素氮與空白對照組比較差異顯著。腺嘌呤本身就可導致大鼠慢性腎功能衰竭［11］，其造模引起的腎臟病變也并非全因高尿酸血癥引發(fā)，故不宜作為理想的高尿酸血癥模型藥物。

本實驗采用尿酸前體物質(zhì)，尿酸排泄抑制劑和尿酸酶活性抑制劑三者聯(lián)合應用造模，較好的模擬了人體尿酸代謝異常的過程，且可以保證在整個過程中高尿酸血癥持續(xù)維持，適合于高尿酸血癥治療藥物藥效及作用機制的篩選，此為本次實驗的突出創(chuàng)新點。若需建立穩(wěn)定持續(xù)、長期可用的高尿酸血癥大鼠模型，可考慮適量減少飼料中次黃嘌呤量，使動物血尿酸值升高控制在更為合理及安全的水平上。由于人類在進化過程中，編碼尿酸酶的基因發(fā)生了突變，尿酸酶缺乏，而大鼠體內(nèi)尿酸酶的存在，使其造模較為困難［12］，建立更合乎人類發(fā)病機制、與人體尿酸代謝異常相似的動物模型，仍需繼續(xù)探索，目前可根據(jù)實驗條件及研究需要選擇合適的動物及造模方法。

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（責任編輯：駱歡歡）

R589.7

A

0256-7415（2015）06-0273-04

10.13457/j.cnki.jncm.2015.06.128

2014-12-12

國家自然科學基金項目（81173194）

施琬（1990-），男，在讀碩士研究生。

韓彬，E-mail：hblz99@21cn.com。