劉梁，陳新，周威

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，湖北武漢430023）

蜂膠黃酮與ctDNA的相互作用

劉梁1，陳新1，周威2

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023；2.武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院，湖北武漢430023）

研究蜂膠黃酮與ctDNA的相互作用及方式；采用紫外-可見吸收光譜法，通過比較不同濃度ctDNA與蜂膠黃酮化合物反應(yīng)后的吸光度變化，根據(jù)吸收曲線得出黃酮化合物與ctDNA在不同條件下的結(jié)合常數(shù)；加入ctDNA后蜂膠黃酮的吸光強(qiáng)度明顯下降，出現(xiàn)減色效應(yīng)，不同pH條件下，黃酮和ctDNA的結(jié)合常數(shù)也不同；蜂膠黃酮可以和ctDNA發(fā)生有效結(jié)合，結(jié)合強(qiáng)度受pH變化的影響。

蜂膠；ctDNA；黃酮；結(jié)合

蜂膠被譽(yù)為“紫色黃金”，是蜜蜂用從植物嫩芽及樹干上采集的樹脂并混入自身上顎腺分泌物和蜂蠟混合而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。蜂膠中含40余種不同結(jié)構(gòu)的黃酮化合物。黃酮類化合物有抗炎、抗病毒、利膽、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用。近年來，國內(nèi)外對黃酮類化合物生理生物活性的研究，隨著生物學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)等的發(fā)展而發(fā)展，把生理現(xiàn)象的研究迅速推向細(xì)胞水平與分子水平，從而揭示了某些黃酮類化合物的作用本質(zhì)，闡明了其作用原理［1-5］。

DNA是體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，決定著生物體的生長、繁殖、遺傳、變異和轉(zhuǎn)化等生命過程。DNA作為一種重要的細(xì)胞受體，尤其DNA與小分子相互作用的機(jī)理，是目前生命科學(xué)、化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)中共同關(guān)注和感興趣的課題，近年來，由于醫(yī)藥學(xué)和生命科學(xué)的發(fā)展，研究小分子與DNA的相互作用機(jī)理過程，對藥代動(dòng)力學(xué)的認(rèn)識和開發(fā)新藥有極其重要的意義。許多藥物是通過與DNA結(jié)合來改變DNA的復(fù)制，從而抑制細(xì)胞的生長，這是設(shè)計(jì)新的更加有效的藥物的基礎(chǔ)。藥物的活性決定于它們與DNA的結(jié)合方式和它們之間的親和力。在研究藥物小分子與DNA的相互作用方式上，眾多學(xué)者做了許多研究。在藥物小分子與DNA的相互作用上，存在不同的結(jié)合方式。目前，比較常見的方法是采用溴化乙錠作為熒光探針對小分子與DNA的作用進(jìn)行研究［6-8］。

黃酮類化合物對DNA分子氧化損傷有保護(hù)作用，而黃酮化合物與DNA分子發(fā)生相互作用是其具有以上活性的關(guān)鍵因素。小分子化合物與DNA相互作用的作用方式有：（1）小分子與DNA之間的氫鍵作用；（2）小分子與DNA分子間的靜電作用；（3）插入作用［9-11］。本文以從蜂膠中分離得到的3個(gè)黃酮化合物為研究對象，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示，通過紫外-可見分光光度法考察它們與ctDNA的相互作用，為蜂膠產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與設(shè)備

黃酮化合物，由武漢輕工大學(xué)醫(yī)學(xué)與護(hù)理學(xué)院周威老師提供；小牛胸腺DNA（ctDNA），北京華美生物工程有限公司產(chǎn)品，用0.05 mol/mL的NaCl溶液配置成0.5 mol/mL的儲備液，處理好的ctDNA溶液放于4℃的冰箱中保存，測量ctDNA在260 nm處的吸光度，DNA的濃度由吸光值A(chǔ)260和摩爾消光系數(shù)A=ε·c·L確定，則ctDNA濃度為8.2×10-4mol/L。lambda 25紫外可見分光光度計(jì)（美國PE公司）；pH為3.0、5.0、5.8、7.4、8.4的緩沖溶液，所用溶劑為雙蒸水。

圖1　蜂膠中黃酮化合物（1）-（3）分子結(jié)構(gòu)Fig.1The molecular structures of propolis flavonoids（1）-（3）

1.2方法

1）在5 mL離心管中，分別加入50 mL的黃酮化合物，后加入500 μL相同pH的緩沖液，再依次加入2、5、10、15、20、30、50 μL的DNA，用雙蒸水定容至2.5 mL，搖勻。以不加DNA的黃酮化合物溶液做空白，加入比色皿中用紫外可見分光光度計(jì)測復(fù)合物吸收曲線的變化。

2）在5 mL離心管中，分別加入等量的黃酮化合物和ctDNA，后加入500 μL不同pH的緩沖液，用雙蒸水定容至2.5 mL，搖勻。以不加ctDNA的黃酮化合物溶液做對照樣品，加入比色皿中測定各個(gè)樣品中復(fù)合物的吸收曲線。

2結(jié)果與分析

黃酮化合物具有一組或多組稠芳環(huán)，它們在一定濃度時(shí)可能通過π-π堆積而形成二聚或多聚，所以我們應(yīng)用吸收光譜滴定進(jìn)行觀察。在紫外光譜儀中，向參比池中加入一定的緩沖溶液，在樣品池中加入一定體積的樣品溶液，不斷增加樣品的濃度直到飽和，樣品的吸收光譜不變。紫外可見吸收光譜吸收法是研究小分子與DNA相互作用機(jī)理的最常見、最方便的方法之一［9］。當(dāng)小分子與DNA結(jié)合后，其電子結(jié)構(gòu)會受到DNA的擾動(dòng)，導(dǎo)致小分子所處的環(huán)境發(fā)生變化，小分子與DNA結(jié)合的強(qiáng)弱［10］可通過光譜變化的幅度反應(yīng)出來。一般情況下，當(dāng)小分子以嵌入模式與DNA作用時(shí)，其吸收光譜會出現(xiàn)一定的峰位紅移效應(yīng)。這是因?yàn)椴迦氲男》肿优cDNA的堿基對發(fā)生π電子堆積后，使其π星空軌道與π電子軌道發(fā)生偶合，能級下降，從而產(chǎn)生紅移現(xiàn)象，同時(shí)，偶合后的π軌道因部分填充電子，躍遷幾率減少，產(chǎn)生紅移現(xiàn)象［11］。為了定量的比較化合物與DNA結(jié)合的強(qiáng)弱，我們通過化合物光譜滴定實(shí)驗(yàn)，以最大波長峰吸光度的變化，按照下列方程式［10］計(jì)算了化合物與DNA的結(jié)合常數(shù)Kb。［ctDNA］/（εa-εf）=［ctDNA］/（εb-εf）+1/Ka（εb-εf）式中：［DNA］表示DNA濃度；εa為共存溶液中化合物的表觀摩爾吸光系數(shù)；εf為未加入ctDNA的化合物的摩爾吸光系數(shù)；εb為化合物與ctDNA鍵合飽和的結(jié)合物的表觀摩爾吸光系數(shù)。以［DNA］/（εa-εf）對［DNA］作圖，斜率與截距的比值為結(jié)合常數(shù)Kb。

表1　不同pH條件下黃酮化合物與ctDNA的結(jié)合常數(shù)KbTable 1Kbof ctDNA and flavonoidscompounds at different pH

化合物（1）-（3）的紫外-可見吸收光譜圖如圖2～圖4所示。

圖2　化合物（1）紫外-可見吸收光譜Fig.2The UV-vis absorption spectroscopy of compound（1）

圖3　化合物（2）紫外-可見吸收光譜Fig.3The UV-vis absorption spectroscopy of compound（2）

圖4　化合物（3）紫外-可見吸收光譜Fig.4The UV-vis absorption spectroscopy of compound（3）

黃酮化合物與ctDNA相互作用后，黃酮化合物的紫外-可見吸收光譜的最大吸收出現(xiàn)減色效應(yīng)，但并未有紅移效應(yīng)出現(xiàn)，說明黃酮化合物不是通過嵌入方式與ctDNA結(jié)合。在不同的pH條件下，二者的結(jié)合常數(shù)有顯著差異，在pH為3.0時(shí)，黃酮化合物與ctDNA的結(jié)合常數(shù)最大，這是由于黃酮分子中羥基發(fā)生質(zhì)子效應(yīng)從而帶正電荷后，與帶負(fù)電荷的DNA分子通過靜電作用結(jié)合。此外，從分子結(jié)構(gòu)上分析可知，在相同條件下分子中所含羥基個(gè)數(shù)越多，其與DNA的結(jié)合常數(shù)值越大，即羥基數(shù)目：（2）＞（3）＞（1），與DNA的結(jié)合常數(shù)顯示（2）＞（3）＞（1）的規(guī)律，這進(jìn)一步驗(yàn)證了蜂膠黃酮與ctDNA分子通過靜電作用方式相互結(jié)合。

3結(jié)論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蜂膠黃酮化合物（1）-（3）可以與ctDNA相互結(jié)合，結(jié)合強(qiáng)度受分子中羥基數(shù)目及反應(yīng)pH條件的影響，相同pH條件下化合物（2）與ctDNA的結(jié)合常數(shù)最大，酸性條件下，蜂膠黃酮與DNA結(jié)合作用最強(qiáng)。不同化合物之間，結(jié)合強(qiáng)度（2）＞（3）＞（1），不同pH條件下，結(jié)合常數(shù)pH3.0＞pH5.0＞pH5.8＞pH7.4＞pH8.4。

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Interaction of Propolis Flavonoids and CTDNA

LIU Liang1，CHEN Xin1，ZHOU Wei2
（1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China；2.School of Health Science and Nursing，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

Explore the interaction and mode between propolis flavonoids and ctDNA.Through the UV-visible absorption spectroscopy measure，comparing the absorbance intensity changes of flavonoids after react with different concentrations ctDNA to analysis the binding constant between propolis and ctDNA.The absorption intensity of propolis decreased when add ctDNA in the sample.The binding constants of flavonoids and ctDNA were also different in different pH conditions.There was an interaction between propolis flavonoids and the binding strength was depend on pH condition.

propolis；ctDNA；flavone；combination

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.11.006

2015-01-27

劉梁（1981—），男（漢），講師，博士，研究方向：食品活性成分研究。