李逸 王潮崗 胡章立

（深圳大學生命科學學院 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，深圳 518060）

利用基因工程技術提高微藻油脂含量的研究進展

李逸 王潮崗 胡章立

（深圳大學生命科學學院 深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，深圳 518060）

利用微藻油脂制備生物柴油因具有重要的戰(zhàn)略意義而受到世界各國的重視，成為近年來的研究熱點。利用微藻制備生物柴油具有生長周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)、能大量吸收CO2及不占用耕地等優(yōu)點。但是，由于對藻類油脂合成代謝中的調(diào)節(jié)機制了解不多，導致微藻基因組研究相對滯后，極大地限制了微藻生物能源的大規(guī)模開發(fā)和利用。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，通過基因工程、代謝工程等方法調(diào)控微藻脂類的合成代謝，提高藻類含油量和生物量已成為可能。概述了微藻中油脂的合成代謝，歸納總結利用基因工程技術提高微藻油脂含量的研究進展，為獲得含油量高的工程微藻及微藻制備生物柴油提供技術儲備。

微藻；基因工程；生物柴油；油脂

隨著經(jīng)濟全球化和人口總量的急劇擴增，極大增加了人們對工業(yè)生產(chǎn)和能源的需求。從21世紀起，能源已是影響人類文明進步的重要因素。據(jù)報道，2050年全球能源需求將會翻一番，目前，全球大約80% 的能源來自化石燃料，包括石油、天然氣等。它們作為一種不可再生能源，全球儲量越用越少，已經(jīng)成為影響地區(qū)穩(wěn)定、經(jīng)濟發(fā)展的主要原因。與此同時，化石燃料的大量使用還引起了氣候變暖、環(huán)境污染等一系列問題。當今社會進入新經(jīng)濟時代，發(fā)展低碳經(jīng)濟，使用可再生、低污染的新型可替代能源已經(jīng)成為當務之急。現(xiàn)在，生物柴油已被各國認為是理想的可再生能源，其主要成分脂肪酸甲酯（fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME）是以可再生資源為原料通過酯交換制備而成，具備與石化柴油相近的性能。其優(yōu)勢如下：是一種可持續(xù)供應的可再生資源；具有高度生物降解性，毒性?。换静粫黾迎h(huán)境污染物的排放；有較高的氧含量，比從石油中提煉出的柴油有更大的燃燒值；能逐步緩解對進口資源的依賴性；生物柴油來源于植物的光合作用，可以緩解生物柴油燃燒所生成的CO2，所以無論是生產(chǎn)還是使用生物柴油都可以有效的減少溫室效應［1，2］。

生物柴油的發(fā)展歷程主要分為3個階段：第一代生物柴油的原料主要是油菜、大豆、棕櫚油和向日葵。第二代生物柴油的原料主要是麻風樹、麻花、煙草種子、三文魚油、廢烹調(diào)油、餐廳油脂和動物脂肪等。第三代生物柴油的原料主要是微藻。第一代和第二代原料因為存在與人爭地、來源有限、原料的效率低和可持續(xù)性差等問題，無法滿足人們的需求，逐漸被第三代原料的微藻所取代［3］。利用微藻生產(chǎn)生物燃料的概念早在50多年前就已提出，它具有其他綠色油脂植物所不具備的優(yōu)點：生長周期短、繁殖速度快、易于大規(guī)模培養(yǎng)、能大量吸收CO2、不占用耕地、單位生物量微藻產(chǎn)油量高于一般油料作物等［2，3］。據(jù)國內(nèi)外報道，油脂含量較高的微藻主要集中在綠藻、金藻和硅藻等真核微藻中，常見的高產(chǎn)油微藻有綠藻中的葡萄藻、小球藻和杜氏鹽藻；硅藻中的三角褐指藻等［2］。這些微藻可以儲存大量的高能化合物，如三酰甘油和淀粉，這些化合物可直接用于生產(chǎn)生物柴油和酒精等生物燃料［1，3，4］。

利用微藻中的油脂生產(chǎn)生物柴油因為具有重要的戰(zhàn)略意義而受到世界各國的關注，成為近年來的研究熱點。然而，應用微藻制備生物柴油存在以下兩方面的問題：獲得油脂含量高的工程藻株以及降低后續(xù)生產(chǎn)成本，這是微藻制備生物燃料能否工業(yè)化生產(chǎn)的關鍵，特別是獲得油脂含量高的基因工程藻株，對微藻制備生物燃料的下游生產(chǎn)工藝具有巨大的影響［5-7］。在本篇綜述中，我們將重點闡述通過基因工程構建高產(chǎn)油藻的途徑，歸納總結近年來微藻產(chǎn)油的研究進展，為獲得含油量高的工程微藻及微藻制備生物燃料提供技術儲備［8］。

1 微藻油脂合成路徑的探究

人們對于植物脂肪酸的代謝路徑了解較多，如擬南芥、油菜等，其產(chǎn)油路徑已有報道。但是，對于藻類的脂肪酸代謝路徑了解還不夠準確。圖1是根據(jù)植物脂肪酸合成路徑及近年來的研究推導出的藻類脂肪酸合成路徑圖。

圖1 微藻脂代謝路徑圖

微藻中油脂的合成路徑主要分為兩個部分，包括自由脂肪酸的合成和三酰甘油的合成（即Kennedy路徑），兩個路徑分別發(fā)生在質(zhì)體和細胞質(zhì)中，其中的質(zhì)體為葉綠體，在葉綠體中生成自由脂肪酸后，被轉運到質(zhì)體外進行三酰甘油（triacylglycerol，TAG）的組裝合成。藻細胞中的糖酵解路徑為脂肪酸合成提供原材料乙酰輔酶A（Acetyl-CoA），乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase，ACCase）的催化下生成丙二酸單酰輔酶A（Malonyl-CoA），這步反應是不可逆的，是脂肪酸合成的關鍵步驟。經(jīng)脂肪酸合酶的催化生成自由脂肪酸，并從質(zhì)體中進入細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上開始三酰甘油的組裝。Kennedy路徑主要是由3種?；D移酶包括甘油3-磷酸?；D移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）、溶血磷脂酸?；D移酶（lysophosphatidic acid acyltransferase，LPAAT）和二酰甘油?；D移酶（diacylglycerol acyltransferase，DAGAT）起作用，最終合成TAG。

2 三酰甘油合成路徑的改造

對于微藻基因組的研究在近幾十年已有很大進步，建立了表達序列標簽（EST）數(shù)據(jù)庫，一些微藻的核、線粒體和葉綠體基因組也已經(jīng)測序完畢。目前總基因組測序完畢的有萊茵衣藻（Chlamydomo-nas reinhardtii）、三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）、紅藻（Cyanidioschyzon merolae）及綠色鞭毛藻（Ostreococcus lucimarinus）等［9，10］。

2.1 微藻中CO2的固定

在工業(yè)化培養(yǎng)的光生物反應器和農(nóng)業(yè)化培養(yǎng)的開放池中培養(yǎng)藻時，提高太陽能利用率很重要，不僅在微藻中，在現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如何提高農(nóng)作物光合效率也成為研究重點［11，12］。改造的關鍵在于葉綠體，大多數(shù)葉綠體的基因組可以進行高效同源重組，微藻葉綠體轉化技術也相對成熟，如基因槍的應用和篩選標記的開發(fā)。通過基因工程方法改造微藻葉綠體基因，提高其光合效率，可以促進微藻對環(huán)境中二氧化碳的利用。研究發(fā)現(xiàn)，利用基因工程將萊茵衣藻中的葉綠體基因組導入酵母細胞中，實現(xiàn)了二氧化碳固定效率和光合效率的提高［13］。

二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCO）是一種初級二氧化碳固定酶，屬于光合作用C3路徑中的重要羧化酶。微藻細胞在進行光合作用時，利用核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCO）將CO2催化生成3-磷酸-甘油酸。盡管研究人員已經(jīng)通過不同的試驗在植物和藻類中證明了RuBisCO的功能，且它在所有的光合有機體中含量最多，但它的效率是最低的［14］。對RuBisCO進行改造可以提高其固碳率，增加光合效率，從而增加微藻的產(chǎn)量。近年來一些文獻報道，RuBisCO在促進脂肪酸合成的同時也發(fā)揮一定的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在油菜種子中RuBisCO的活性與油脂的形成有關，同時可以促進種子中乙酰輔酶A的含量提升。由此推測，RuBisCO活性的增加可以使更多的碳源流向后續(xù)反應，從而影響油脂的代謝，微藻中RuBisCO的研究并沒有太多報道，還需要更多的研究去證實［1，9］。

與固碳作用有關的另外一種酶是碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CA）。在微藻中，碳酸酐酶可以催化CO2和HCO3-之間的轉換［15］。碳酸酐酶分為α型、β型和γ型3種，已經(jīng)在藍細菌（Cyanobacteria）中發(fā)現(xiàn)了類似CA功能的蛋白，萊茵衣藻（Chlamydomonas rerhardtii）中存在的是α型和β型，涉及到的基因有12個。Sinetova等［16］在2012年發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻的CA缺陷株與野生型相比，在二氧化碳濃度增加的條件下，細胞膜上多不飽和脂肪酸含量增加幅度較小，因此推測碳酸酐酶與微藻的產(chǎn)油量存在一定關系。

2.2 自由脂肪酸合成路徑的改造

最早關于微藻脂肪酸合成相關酶的研究是乙酰輔酶A羧化酶（ACCase），它是脂肪酸合成過程中的關鍵酶，負責催化脂肪酸合成的第一步反應，將乙酰輔酶A催化成丙酮酸輔酶A。ACCase分為2類，即異質(zhì)型和同質(zhì)型［17-19］。

在酵母和其他高等真核生物中ACCase的活性和表達量與脂肪酸含量有密切關系，Shi等［20］發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母（S. cerevisiae）中過量表達改造后酶活性提高的ACCase時，釀酒酵母油脂含量最多增加65%。大腸桿菌中（Escherichia coli）中ACCase的過量表達使得總脂含量增加為原來的6倍［21］。但是，通過增加ACCase的表達量促進脂肪酸合成在微藻中并不成功。Dunahay等［22］增加硅藻（C. cryptica和N. saprophila）中ACCase的表達量，盡管ACCase的表達量增加2-3倍，但脂肪酸含量無明顯增加。在隱秘小環(huán)藻（Cyclotella cryptica）、舟形藻（Navicula saprophila）中過量表達ACCase均未導致脂類含量明顯增加。存在的原因可能有兩個，一是ACCase酶結構復雜，堿基數(shù)多，對其改造難度較大；二是ACCase雖然是限速酶，但與終產(chǎn)物三酰甘油的距離較遠，加上微藻中還存在反饋抑制的調(diào)控，這大大減弱了ACCase的作用。

脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）是一個多亞基多酶復合體，脂肪酸合酶以丙二酰輔酶A為底物，每進行一個循環(huán)增加2個碳原子，最后形成16碳的軟脂酰-ACP和18碳的硬脂酰-ACP，再形成二十二碳六烯酸（docosahexaenois，DHA）和花生四烯酸（arachidonic acid，ARA）等長鏈多不飽和脂肪酸［1，23］，很多藻的FAS已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。FAS作為一個多酶復合體，它的底物通常有多個酶結合位點，產(chǎn)物的合成由多個酶調(diào)節(jié)。因此，單一的改變其中一種酶活性，只能改變某一種油脂成分的含量，對脂肪酸總量的影響不大。2001年，Dehesh等［23］克隆了菠菜中3-酮脂酰-?；d體蛋白合成酶III（KASIII）的cDNA序列，分別在煙草細胞、橄欖型油菜和擬南芥中進行過表達，結果增加了這3種植物中飽和脂肪酸（16∶0）的含量，總脂的合成率沒有明顯提高。以上研究說明，F(xiàn)AS多亞基、多調(diào)控機制的特性導致人們不能通過單一的酶基因改變來提高總的脂肪酸含量（表1）。

表1 部分基因在提高脂肪酸含量中的應用

2.3 TAG組裝路徑（Kennedy路徑）的改造

TAG路徑是指三酰甘油的形成路徑，脂肪酸在質(zhì)體中形成后，被運送到細胞質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，與甘油進行組裝，主要包括：3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol-3-phosphate dehydrogenase，G3PDH）、甘油-3-磷酸酰基轉移酶（glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）、溶血磷脂酸?；D移酶和二酰甘油?；D移酶［24］。在脅迫條件下，TAG合成量的顯著增加就是與4種酶有密切的關系，它們是合成TAG的關鍵酶。目前，關于這些酶的研究主要集中在擬南芥、油菜等高等植物，在大腸桿菌、酵母和微藻中也有少量研究［25］。在不同的物種中?；D移酶的存在形式是不同的。如圖2，為三酰甘油主要合成過程。

2.3.1 甘油-3-磷酸脫氫酶（G3PDH，EC1.1.1.8）

G3PDH負責將磷酸二羥基丙酮（dihydroxyacetoneph-osphate，DHAP）催化形成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G-3-P），反應公式如圖2所示，該反應是甘油代謝途徑中的限速步驟，在還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADH的參與下催化DHAP生成3-磷酸甘油，它決定了甘油合成量的多少［26］。這步反應嚴格說雖不算Kennedy途徑，但為Kennedy路徑提供前體物質(zhì)，決定了目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。

在哺乳動物中，G3PDH與脂肪酸含量的關系研究較多，早在1979年就已經(jīng)確定，在小鼠的3T3細胞脂肪轉換時，G3PDH可以作為晚期分化的重要標志［27］。2014年，Kim等［28］發(fā)現(xiàn)用藥物處理小鼠的前脂肪細胞時，前脂肪細胞的分化被抑制，同時G3PDH的酶活被抑制。與之相似，Yi等［29］發(fā)現(xiàn)用脂肪酸結合蛋白3（H-FABP，F(xiàn)ABP3）刺激小鼠脂肪細胞，三酰甘油總量提高的同時，g3pdh基因的表達量明顯升高，這說明哺乳動物中G3PDH的酶活與脂肪細胞密切相關。

圖2 TAG合成公式

G3PDH在植物和藻類中的研究報道較少。Vigeolas等［30］將一種胞質(zhì)酵母的甘油-3-磷酸脫氫酶基因gpd1轉化到油菜種子中，結果發(fā)現(xiàn)油菜種子中的含油量增加了40%，因為微藻中與脂代謝相關的大部分基因序列與陸生植物的同源性較高。由此推測，G3PDH的過表達或酶活性提高對微藻的油脂量變化有影響，目前本實驗室已根據(jù)萊茵衣藻密碼子偏好性合成該基因，并轉入了萊茵衣藻中進行功能分析，獲得了一些有意義的結果。

2.3.2 甘油-3-磷酸酰基轉移酶（GPAT，EC 2.3.1.15）

GPAT是Kennedy路徑的第一個?；D移酶，負責催化脂肪酰基轉移到3-磷酸甘油的sn-1位上，生成1-?；?3-磷酸甘油。目前，多種高等植物和藻類的GPAT基因序列已經(jīng)分離出來。Jain等［32］在研究萊茵衣藻膜脂代謝時發(fā)現(xiàn)，在光刺激條件下，萊茵衣藻膜脂代謝增加的同時，GPAT的酶活性提高至少10倍。由此推測微藻中脂產(chǎn)量與GPAT的活性有密切關系。通過分子生物學手段將大腸桿菌和紅花（safflower）的GPAT基因轉移到擬南芥中，可以增加種子的含油量和重量，使得擬南芥油脂含量分別提高了15%和22%。Misra等［31］對7種藻類和3種高等植物質(zhì)體中的GPAT進行了序列結構分析，研究GPAT的進化過程發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻、擬南芥和大豆的GPAT序列雖然不同，但都有保守的拓撲結構14α螺旋和9β折疊。這些研究為利用gpat構建基因工程藻提供了重要依據(jù)。

2.3.3 溶血磷脂酸酰基轉移酶（LPAAT，EC 2.3.1.51）

LPAAT負責催化脂酰-CoA上的脂肪酸酰基轉移到溶血磷脂酸的sn-2位，生成磷脂酸（PA）。對高等植物中的研究主要集中在花生、擬南芥和油菜中，它提高產(chǎn)油量的效果顯著。將一個酵母的sn-2?；D移酶（SLC1-1）轉入到基因缺陷型的酵母中，證明該基因編碼的酶可以催化sn-1位溶血磷脂酸，轉入擬南芥后，它能使種子中的油脂含量提高8%-48%不等，其中超長鏈脂肪酸所占比例明顯增多［33］。Knutzon等［34］將來自椰子中的lpaat基因和福尼亞月桂樹中的硫酯酶基因共同轉入油菜中，使得月桂酸產(chǎn)量提高，除了出現(xiàn)在固定位置sn-1和sn-3積累外，在sn-2位上也有積累，菜籽油中的月桂酸含量增加了50%。

研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻在脅迫條件下脂肪酸含量增加時，lpaat等基因的表達量也相應升高，利用基因敲除技術減少lpaat表達量后，中性脂含量降低了20%［35］，由此推測，調(diào)節(jié)lpaat基因的表達量或者增加LPAAT酶的活性可以增加藻類脂肪酸含量。最近的研究表明，LPAAT酶等作用下生成的磷脂對人類疾病，如Chanarin-Dorfman綜合征、癌癥、過渡肥胖和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA，22∶6）的產(chǎn)量等均有影響［36，37］。

2.3.4 甘油二酯酰基轉移酶（DGAT，EC 2.3.1.20）

甘油二酯酰基基轉移酶（diacylglycerol acyltransferase，DGAT）是三酰甘油合成的最后一個酶，催化二酰甘油（DAG）生成三酰甘油，同時也可以催化磷脂酸生成二酰甘油，使其進入油脂生物合成路徑，是TAG合成反應的重要限速酶。DGAT主要分為4種類型：DGAT1、DGAT2、Cyto DGAT和WS/DGAT。DGAT1和DGAT2蛋白主要結合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是微粒體酶；Cyto DGAT和WS/DGAT是近年發(fā)現(xiàn)的新類型。

DGAT的過表達已經(jīng)在酵母、哺乳動物、植物和昆蟲中實現(xiàn)［38-40］，證實對于脂肪酸含量都有影響。最早關于DGAT影響產(chǎn)油量的報道是在2001年，Jako等［41］將DGAT的cDNA導入野生型擬南芥中進行過量表達，結果DGAT的活性增加了10%-70%，種子含油量也有所增加。將擬南芥的dgat基因分別在酵母和煙草中進行過量表達，使得酵母中DGAT活性增加了200-600倍，TAG含量提高為原來的3-9倍，煙草中TAG含量提高7倍。Zhang等［2］用特異性hpRNA沉默煙草中的DGAT1基因，煙草種子的含油量下降了9%-49%。過量表達DGAT使得脂肪酸含量顯著提高，這可能是因為DGAT催化兩條相關代謝步驟，使得更多的二酰甘油生成TAG。

萊茵衣藻因其培養(yǎng)簡單、背景清晰、轉化技術成熟成為微藻研究領域的模式生物，也是研究脂肪酸合成代謝最好的試驗材料。Lv等［35］在對萊茵衣藻積累脂肪酸時的轉錄進行分析時發(fā)現(xiàn)，超過2 500種基因的上調(diào)，lpaat和dgat被抑制后，脂肪酸產(chǎn)量下降。本實驗室目前將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的lpaat和gpd1基因轉入萊茵衣藻中，研究其基因表達量和脂肪酸含量提高程度，取得了較好的研究結果，為獲得油脂含量高的基因工程藻提供了新思路。

3 旁路代謝路徑的調(diào)控

旁路代謝路徑是指除脂肪酸代謝路徑之外的其他代謝路徑，如三羧酸循環(huán)等。這些路徑分擔了部分碳流，使得流向脂肪酸合成的碳源變少，所以對于這些代謝路徑中關鍵酶的調(diào)節(jié)通常會影響到脂肪酸的含量。

3.1 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC，EC4.1.1.31）

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase，PEPC）是一種在有機體中廣泛存在的細胞質(zhì)酶，主要存在于古細菌、細菌、單細胞綠藻和維管束植物等有機體中［42］。在C4植物和景天酸代謝（crassulacean acid metabolism，CAM）植物中，PEPC在CO2固定過程中起到重要作用；在C3植物和非光合組織中，PEPC在檸檬酸反應中催化不可逆反應，使得磷酸烯醇式丙酮酸鹽（PEP）生成草酰乙酸鹽（OAA）。所以，PEPC是碳源是否流向脂肪酸合成鏈的關鍵酶。

在對磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的研究中，可以利用RNA沉默技術抑制pepc的表達。1999年Chen等［3］發(fā)現(xiàn)，油菜籽中的pepc沉默后，其產(chǎn)油量提高了6.4%-18%，表明脂肪酸含量與PEPC酶活性為負相關，同樣的研究結果也出現(xiàn)在微藻中。在萊茵衣藻和三角褐指藻中，利用RNAi技術使pepc1和pepc2基因沉默后，萊茵衣藻（C. reinhardtii）的油脂含量分別提高了14%-28%和20%［43］。另外，通過抑制PEPC酶活性，同樣可以顯著提高微藻（如綠藻，硅藻等）的脂含量［44，45］。

3.2 檸檬酸合成酶（CIS，E.C. 2.3.3.1）

檸檬酸合成酶是三羧酸反應循環(huán)的第一步，有多種同工酶，存在各種亞細胞結構中，在多種生理代謝路徑中起作用，位于線粒體中的檸檬酸合成酶在三羧酸循環(huán)中起到限制性酶的作用，負責將乙酰輔酶A催化成檸檬酸。

在對植物和動物的研究中發(fā)現(xiàn)，檸檬酸合成酶的作用主要集中在如下3方面：（1）該基因的過表達可以促進農(nóng)作物分泌檸檬酸，促進磷在土壤中的溶解，增加土壤中磷的利用率［46，47］；（2）增加細胞對鋁毒素的抵抗作用［48］；（3）CIS基因的表達與水果成熟過程中有機酸的積累有關。Zhang等［49，50］發(fā)現(xiàn)，在松子果成熟期間，檸檬酸含量與CIS的活性有關。

早在1973年，Taylor等［51］研究了4種藍藻的CIS活性發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下更多的碳原子進行脂肪酸合成時，CIS活性下降。Deng等［52］最近研究了萊茵衣藻中的CrCIS與脂肪酸含量的關系，利用RNAi抑制CrCIS的活性，使得萊茵衣藻中的TAG含量增加了169.5%，結果表明萊茵衣藻中檸檬酸合成酶的活性可以影響脂肪酸的積累代謝。

近年來，RNA干擾技術逐漸被microRNA技術所代替，microRNA是一類長度很短的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，由一段具有莖環(huán)結構的長度為70-80 nt的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer加工之后的一類非編碼的小RNA分子（約21-23個核苷酸），在動物和植物中廣泛表達，是一類新型的調(diào)控基因表達的小分子RNA，它作為基因表達的負調(diào)控因子，在轉錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達。因此，利用microRNA技術調(diào)控的專一性更強，表達也更穩(wěn)定，可控性更好［45，53］。

4 脂肪酸分解代謝路徑

脂肪酸和TAG合成相關基因的激活或者脂肪酸β-氧化酶對應基因的失活，都可以增加脂肪酸產(chǎn)量。在提高微藻脂肪酸產(chǎn)量的策略中，減少脂肪酸的分解代謝也是重要的方法之一。脂肪酸的分解代謝路徑主要是β-氧化，具體的脂肪酸分解路徑，如圖3，它存在于真核生物的線粒體基質(zhì)和原核生物的細胞溶膠中，現(xiàn)階段該方法多在高等植物和酵母中實驗成功。

圖3 脂肪酸分解代謝路徑圖

在一些情況下，細胞依靠脂肪酸β氧化提供能量，敲除脂肪酸分解代謝對應基因后，在增加脂肪酸儲存量的同時也會影響細胞的生長和增值。例如，在擬南芥中，將過氧化物酶長鏈乙酰輔酶A合成酶抑制后，同工酶LACS6和LACS7失活，雖然種子的油脂含量增加了，但是種子由于碳源的缺失使得生長速度受到抑制［17］。Germain等［18］還將3-酮脂酰-CoA硫解酶（KAT2）失活，結果也是相同的。

脂肪酸氧化有多個酶共同參與，完全抑制這個過程的難度較大。擬南芥中含有短鏈乙酰輔酶A氧化酶，包括ACX3和ACX4，如果只是突變其中一個基因，擬南芥種子的生長和脂肪酸的代謝并未受到影響，如果兩個基因同時突變會導致擬南芥死亡［19］。通過基因工程技術敲除釀酒酵母（S. cerevisiae）中的β氧化酶基因，不僅使得內(nèi)源性脂肪酸含量增加，還可以促進脂肪酸的胞外分泌［14，54，55］。

5 誘發(fā)突變

突變在自然界中廣泛存在，實驗中用到的多為誘發(fā)突變，即人為條件下誘發(fā)產(chǎn)生的基因突變。通過基因突變改造微藻，使其產(chǎn)油量提高，也是一種可行性較高的方法。誘發(fā)突變的方法常用的有紫外誘變、抗性基因插入等，這些方法適用范圍廣，且便于操作。還可以通過抑制其他化合物代謝路徑（如淀粉合成路徑）來增加脂肪酸合成。研究顯示，利用插入突變得到萊茵衣藻的兩個淀粉合成缺陷株sta6和sta7，發(fā)現(xiàn)其ADP-葡糖焦磷酸化酶基因異淀粉酶基因功能受損［1］。2006年，Ramazanov等［56］通過紫外誘變獲得小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的淀粉突變株，它的不飽和脂肪酸含量有所提高。2013年，劉飛飛等［57］將博來霉素抗性基因ble隨機插入三角褐指藻基因組中，構建突變體文庫，篩選得到含油量顯著變化的突變株。但是，利用誘發(fā)突變篩選突變株的不確定性高，目的性不強，篩選工作量大。

6 分泌型藻株

利用微藻制備生物柴油需要通過大規(guī)模的培養(yǎng)獲得足夠多的微藻來提取油脂，微藻由于體積微小導致后續(xù)收集成本較高，除了步驟繁瑣，花費也比較大。例如，利用靜置沉淀或者絮凝沉淀等收集藻細胞可以節(jié)約成本，但存在耗時長、需要進一步脫水處理等問題。目前可替代的方法是離心法和過濾法，其優(yōu)點是耗時短，但成本較高。大多數(shù)產(chǎn)油微藻有堅硬的細胞壁，這使得提取油脂難度加大。有一種解決方法是改造微藻細胞，使其將油脂自動分泌到培養(yǎng)液中，通過油水分離可以獲得藻細胞中合成的油脂。

6.1 酵母中自由脂肪酸的分泌

如上所述，在脂代謝中，β-氧化酶基因的失活在某些情況下會導致脂肪酸分泌，通過對缺陷型酵母的研究，確定了這些基因在脂肪酸分泌中有重要作用［14，54］。釀酒酵母（S. cerevisiae）中有5種基因與脂肪酸乙酰輔酶A合成酶活性有關，包括編碼FAA1和FAA4的基因。FAA1和FAA4同時失活或者FAA1和乙酰輔酶A氧化酶同時失活都會導致細胞內(nèi)自由脂肪酸的累積和分泌，但脂肪酸的分泌往往會減少細胞數(shù)目［14］，原因是脂肪酸的分泌主要發(fā)生在酵母的對數(shù)生長期，而脂肪酸的積累則發(fā)生在細胞的平臺期［55］。酵母中TAG或者自由脂肪酸分泌的機制尚不清晰。根據(jù)研究可知，任何使得酵母細胞積累高水平自由脂肪酸的機制都可以使自由脂肪酸從細胞中分泌出來。Roessler等［58］通過合成基因組學研究發(fā)現(xiàn)了藍細菌也存在類似的脂肪酸分泌機制。

6.2 脂肪酸和相關化合物的分泌機制

目前，一些親脂性化合物的分泌路徑已明確，包括從肝細胞分泌的含有TAG的極低密度脂（VLDL）小泡、從乳腺分泌的含TAG小泡和由多種碳氫化合物組成的植物蠟的ABC轉運機制［59，60］。除了細胞輸出路徑，還有許多細胞內(nèi)不同細胞器之間的脂肪酸運輸也已經(jīng)了解清楚，如脂肪酸進入線粒體和過氧物酶體進行β氧化，或許可以利用這些機制將脂肪酸運輸?shù)郊毎?。這些路徑中一些主要的基因已經(jīng)明確，ABC轉運體（transporters）的轉基因表達已經(jīng)應用于藥物運輸。然而，這些成功的轉基因表達和脂肪酸分泌路徑的改造是否適合生物燃料的生產(chǎn)，有待進一步證實［61，62］，明確的分泌機制也有待進一步探索。

目前，促進微藻分泌脂肪酸最直接的方法就是利用ABC轉運體。ABC轉運體可以介導植物細胞中蠟質(zhì)的分泌，也可以將長鏈脂肪酸運輸?shù)竭^氧化物酶體中進行β-氧化。擬南芥（A. thaliana）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過120種不同的ABC轉運體，它們除了轉運超長鏈脂肪酸外，還可以轉運其他次級代謝產(chǎn)物，如萜類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的Desperado/ AtWBC11轉運體和Cer5/AtWBC12轉運體能夠促進蠟分泌到植物表層［63，64］。另外，ABC轉運系統(tǒng)相關酶基因的轉基因表達可以增加卡那霉素、膽固醇和固醇等化合物的輸出［65-67］。

總之，利用微藻制備生物柴油尚處于試驗階段，通過基因工程技術促進脂肪酸分泌到培養(yǎng)系統(tǒng)，并利用油水分離收集脂肪酸，其成本較傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝低很多，但是脂肪酸的分泌量還很難達到工業(yè)化生產(chǎn)的需要，需要人們對脂肪酸分泌機制了解更多，最終實現(xiàn)可應用的脂肪酸分泌系統(tǒng)和技術［68，69］。

7 展望

隨著陸地資源的減少，海洋資源的開發(fā)逐漸被人們關注，其中，微藻能源的開發(fā)就是研究的重點。微藻是多樣化的有機體，具有許多獨特的代謝特性：高光合傳遞速率、快速的生物量生產(chǎn)速率、適應多種環(huán)境和可以生產(chǎn)多種類的生物柴油等特點?；谖⒃逯苽渖锶剂系膽?zhàn)略意義，多國包括中國投入了大量的人力、物力，已經(jīng)取得了階段性的成果。許多藻類的基因組序列已經(jīng)測序完畢，如萊茵衣藻、三角褐指藻和小球藻等。微藻的遺傳轉化體系也日漸完善，萊茵衣藻、小球藻、鹽藻和硅藻等已建立了高效的表達體系。另外，微藻積累脂肪酸的機制、脂肪酸合成相關基因的克隆及功能研究也已經(jīng)完成，對其合成調(diào)控機制有了初步認識。同時，利用基因工程手段提高脂肪酸合成相關酶基因的轉錄及表達水平的研究也表現(xiàn)出不同的效果，某些FAS酶和TAG組裝酶對油脂合成的影響較明顯，Kennedy路徑中任何一種?；D移酶的表達量增加都會導致TAG含量增加［1］。生物體內(nèi)的代謝路徑相互聯(lián)系、相互影響，對于其他代謝路徑，如三羧酸循環(huán)和磷脂酸合成路徑的調(diào)節(jié)均會影響到脂肪酸含量的變化。如用反義RNA技術對pepc基因進行調(diào)控，使得微藻萊茵衣藻的脂肪酸含量提高了20%［44］。以上研究也說明微藻中脂肪酸代謝體系比較復雜，是一個多酶參加的生物合成過程，受到多種因素的影響，還有未知的調(diào)控機制在起作用。因此，也有人試圖通過轉錄因子來調(diào)控脂肪酸的合成代謝，它不只是調(diào)控一種酶而是對應著多個基因，效果會更明顯，這也是未來微藻油脂合成調(diào)控研究的重要方向。

盡管微藻產(chǎn)油存在多種優(yōu)勢，但相比陸地植物來說，其大規(guī)模培養(yǎng)仍然受限，尚有許多問題需要解決，如脂肪酸代謝路徑、密碼子偏好性、高表達載體等方面。微藻大規(guī)模培養(yǎng)技術及獲得油脂含量達到商業(yè)開發(fā)水平的工程藻仍是整個生產(chǎn)環(huán)節(jié)的關鍵。微藻的培養(yǎng)和收集模式以及后期脂肪酸提取方法的革新都可能會降低生產(chǎn)成本。未來關于基因工程藻的研究可能集中在如下幾個方向：（1）Kennedy路徑中各個?；D移酶的改造；（2）利用轉錄因子綜合調(diào)控脂類代謝過程；（3）研究脂肪酸自動分泌的相關基因，以減少脂肪酸的提取成本。

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Advances of Genetic Engineering of Microalgae for Improving Lipid Production

Li Yi Wang Chaogang Hu Zhangli
（Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources and Ecology，College of Life Sciences，Shenzhen University，Shenzhen 518060）

In recent years， microalgae oil biodiesel has become a hot spot because of its strategic importance. Microalgae are a promising feedstock for biodiesel due to their short growth cycle， easy to mass culture， ability to absorb CO2and no taking farmland， etc. However， largescale development and utilization of microalgae biomass energy is limited by less knowledge about metabolic mechanisms of lipid synthesis and lagging research of genome in microalgae. With the development of modern biotechnology， improving lipid content and biomass of microalgae may achieve through genetic engineering and metabolic engineering methods. This review describes recent efforts to metabolic mechanisms on lipid biosynthesis and genetic engineering techniques on increasing lipid content， which provide technical reserves for attaining high lipid transgenic microalgae and producing microalgae biodiesel.

microalgae；genetic engineering；biodiesel；lipid

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.04.010

2014-08-03

國家自然科學基金項目（41176106，31000162和31070323），深圳市科技計劃項目（CXB201104210005A，JCYJ201206131125-12654，JSGG20130411160539208）

李逸，女，碩士研究生，研究方向：藻分子生物學；E-mail：811054831@qq.com

王潮崗，男，博士，研究方向：藻類學；E-mail：charlesw@szu.edu.cn