孫振剛，武文起，馮永強(qiáng)，胡志和，趙勇

（1.天津海河乳業(yè)有限公司，天津300402；2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

α2-f（56-57）：Y S的ACE活性抑制作用及在酸奶中的應(yīng)用

孫振剛1，武文起1，馮永強(qiáng)1，胡志和2，*，趙勇2

（1.天津海河乳業(yè)有限公司，天津300402；2.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

評價乳源肽α2-f（56-57）：YS的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）活性抑制作用及降壓效果，并將其應(yīng)用于發(fā)酵酸奶，制備具有降壓作用的發(fā)酵酸奶。采用分光光度法檢測α2-f（56-57）：YS對ACE活性的抑制作用，用不同劑量的α2-f（56-57）：YS及添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶灌胃原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），評價其降血壓效果。結(jié)果表明，片段α2-f（56-57）：YS具有很好的ACE活性抑制作用，其IC50值為11.89 μg/mL；體內(nèi)檢測表明，用低、中、高（1、3、9 mg/kg mb）劑量灌胃原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），均顯示有降血壓作用，在灌胃后4 h，其血壓分別降低了18.25、31.38和36.88 mm Hg，8 h后恢復(fù)到初始血壓值。添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶，以10 mL/kg mb的劑量灌胃SHR，在灌胃后4 h，對SHR的收縮壓（SBP）降低了32.5mm Hg，8 h后恢復(fù)到初始值。因此，α2-f（56-57）：YS具有降血壓作用，應(yīng)用于發(fā)酵酸奶中，可制備具有降壓功能的酸奶。

ACE活性抑制肽；α2-f（56-57）：YS；發(fā)酵酸奶；降血壓

隨著人們生活水平的提高，生活方式和飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，現(xiàn)代文明病，包括肥胖癥、糖尿病、心血管疾病等，接踵而來。其中，心血管疾病的發(fā)病率在我國呈逐年快速上升趨勢。心血管疾病以冠心病為主，冠心病又稱冠狀動脈硬化性心臟病，而高血壓是動脈粥樣硬化的重要危險因素[1]，且血壓水平與心血管發(fā)病危險呈正相關(guān)[2]。在WHO/ISH、ESH/ESC和中國高血壓治指南[3-5]中強(qiáng)調(diào)了控制收縮壓的重要性，闡述了聯(lián)合用藥干預(yù)心血管危險因素的高血壓治療新觀念，但降壓藥物都有一定的毒副作用[6]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，食物蛋白質(zhì)水解后形成的一些小分子多肽具有明顯的降血壓作用，它與普通降壓藥物相比沒有無毒副作用，且對正常的血壓沒有影響，因而成為目前抗高血壓功能食品或藥物研究的熱點(diǎn)[7]。

目前，研究較多的是乳源降壓肽，乳不僅能提供豐富的營養(yǎng)，而且還是許多生物活性肽的重要來源[8]。研究者采用蛋白酶水解的方法，從牛乳酪蛋白[9-13]和乳清蛋白[14-18]中分離出多種生物降血壓肽，另外，還從發(fā)酵的乳制品中分離出多種具有降壓功能的活性肽[19-24]。

本文利用胃蛋白酶和胰蛋白酶，先后水解乳酪蛋白，分離純化獲得肽片段α2-f（56-57）：Tyr-Ser（YS），對其ACE活性抑制作用及降血壓作用進(jìn)行評價，將其與乳混合發(fā)酵，制作具有降血壓功能的發(fā)酵乳，為功能性乳制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳酪蛋白源肽α2-f（56-57）：YS：天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院專業(yè)實(shí)驗(yàn)室制備，經(jīng)HPLC和MS分析純度大于95%；直投式乳酸菌菌種（HANSEN YFL812 50U）：HANSEN公司；N-Hippuryl-His-Leu hydrate（HHL）、AngiotensinConvertingEnzymeACE：Sigma公司。

實(shí)驗(yàn)動物：原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；正常Wistar大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FLUKOFA-25均質(zhì)機(jī)：上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；LRH-70生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì)：日本Unico公司；BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計(jì)：北京軟隆科技有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 α2-f（56-57）：YS片段的ACE活性抑制的體外檢測

1.3.1.1 分光光度方法體外檢測ACE活性抑制率

采用分光光度方法[25-26]體外檢測ACE活性抑制率，具體方法見表1。

表1 ACE活性抑制體外檢測方法Table 1 Detection method of ACE activity inhibition in vitro

硼酸鈉緩沖液：含有0.3 mol/L NaCl的0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH8.3）；HHL試劑：溶于硼酸鈉緩沖溶液，配成濃度為5 mmol/L，分裝后-20℃保藏；ACE試劑：將0.25U的ACE用2.5 mL的硼酸鈉緩沖溶液溶解，配成0.1 U/mL，分裝后-20℃保藏；抑制劑：用硼酸鈉緩沖溶液溶解樣品至不同濃度。

根據(jù)表1，將各試劑加入到5 mL離心管中混勻（每管做三組平行），反應(yīng)結(jié)束后加入1.7 mL乙酸乙酯，經(jīng)15s振蕩、混勻后離心（4 000 r/min，15 min，4℃），吸取1.0 mL乙酸乙酯層于試管中，在120℃的烘箱中烘干30 min后，向試管中加入3 mL去離子水，檢測在228 nm處的吸光度，其計(jì)算公式為：

式中：A為反應(yīng)中ACE抑制劑和ACE同時存在的細(xì)光度；B為反應(yīng)中不加抑制劑的吸光度，即對照；C為ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。

1.3.1.2 半數(shù)抑制濃度（IC50）的測定

稱取α2-f（56-57）：YS，分別配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、40、60 μg/mL的溶液，測定各溶液的ACE抑制率，并繪制ACE抑制率曲線，計(jì)算出IC50值。

1.3.2 添加α2-f（56-57）：YS發(fā)酵酸奶制備

按照100 mg殺菌的鮮牛奶添加60 mg的α2-f（56-57）：YS的比例混合，進(jìn)行充分混合，接種0.06%直投乳酸菌（HANSEN YF-L812 50U），42℃發(fā)酵5 h，獲得發(fā)酵酸奶。

1.3.3 α2-f（56-57）：YS及其發(fā)酵酸奶的動物實(shí)驗(yàn)

1.3.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組

12周齡雄性原發(fā)性高血壓大鼠（SHR）40只，體質(zhì)量為（260±15）g，自由采食飲水，保持環(huán)境溫度（23± 1）℃，相對濕度（60±5）%，預(yù)飼養(yǎng)1周。大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分別為空白組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，分別灌胃生理鹽水（10 mL/kg mb）、低、中、高劑量的α2-f（56-57）：YS（灌胃劑量為1、3、9 mg/kg mb）。另取Wistar大鼠20只，分為2組，分別作為空白組和正常對照組，灌胃生理鹽水和高劑量α2-f（56-57）：YS。灌胃后檢測血壓變化。

采用同一批SHR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，間隔1周，待其血壓恢復(fù)原值后再進(jìn)行灌胃酸奶測試。取30只SHR大鼠，分為3組，每組10只，分別灌胃生理鹽水、普通發(fā)酵酸奶和添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶，灌胃劑量為10 mL/kg mb。另取Wistar大鼠20只，分為2組，分別灌胃生理鹽水和添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶。灌胃后檢測血壓變化。

1.3.3.2 動物血壓測定

采用血壓計(jì)，測定大鼠尾動脈收縮壓（SBP）[27]。測定前，將大鼠固定于鼠網(wǎng)保溫套中在39℃恒溫預(yù)熱，使尾動脈擴(kuò)張，血流暢通。按照設(shè)計(jì)的劑量灌胃，每天灌胃1次，測定灌胃后1 h～8 h的尾動脈血壓，連續(xù)測3次，取平均值。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，比較各組與對照組之間差異的顯著性，所得結(jié)果應(yīng)用配對t檢驗(yàn)，p＜0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 α2-f（56-57）：YS的ACE活性抑制作用檢測

根據(jù)方法1.3.1，檢測α2-f（56-57）：YS對ACE活性的研制作用，結(jié)果見圖1。

圖1 α2-f（56-57）：YS濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線Fig.1 Relationships between concentrations of α2-f（56-57）：YS and ACE inhibitory activity

根據(jù)擬合方程y=-0.0087x2+1.3878x+27.959計(jì)算α2-f（56-57）：YS對ACE活性的半數(shù)抑制率為IC50= 11.89 μg/mL，因此，該片段具有很好的ACE活性抑制作用。

2.2 α2-f（56-57）：YS降壓作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

按照方法1.3.3（1）設(shè)計(jì)的劑量，灌胃SHR和 wistar大鼠，用BP-2006A型智能無創(chuàng)血壓計(jì)檢測灌胃后其收縮壓（systolic blood pressure，SBP）的變化，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 灌胃片段α2-f（56-57）：YS對SHR血壓的影響Fig.2 Antihypertensive effect of α2-f（56-57）：YS on the SBP of SHR

圖3 灌胃α2-f（56-57）：YS對Wistar大鼠血壓的影響Fig.3 Antihypertensive effect of α2-f（56-57）：YS on the SBP of Wistar

由圖2可知，與生理鹽水組相比，三種劑量的α2-f（56-57）：YS均具有很好的降血壓的作用（p＜0.05），在灌胃后4h，各劑量組均達(dá)到最好降壓效果，低、中高三個劑量組分別降低了18.25、31.38和36.88 mmHg。4 h后，血壓開始緩慢回升，8 h后基本恢復(fù)到原來水平。該結(jié)果表明，α2-f（56-57）：YS片段在體內(nèi)可經(jīng)受胃腸環(huán)境的作用，結(jié)構(gòu)不會發(fā)生變化，保持很好的降血壓的功能。而對正常血壓的wistar大鼠，在高劑量下灌胃，其血壓無顯著變化（p＞0.05）（圖3）。

2.3 添加α2-f（56-57）：YS發(fā)酵酸奶的降血壓作用

根據(jù)方法1.3.2制作添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶，按照方法1.3.3進(jìn)行灌胃SHR，檢測其血壓變化，結(jié)果見圖4。

圖4 添加α2-f（56-57）：YS發(fā)酵乳對SHR血壓的影響Fig.4 Effect of containing α2-f（56-57）：YS fermented milk on SHR systolic blood pressure（SBP）

與灌胃生理鹽水相比，灌胃同等劑量普通發(fā)酵酸奶和添加α2-f（56-57）：YS的酸奶均勻降壓效果，在灌胃后4 h，對SHR的尾動脈收縮壓（SBP），普通酸奶可降低9.8mmHg，而添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶可降低32.5mmHg，在4 h后，血壓開始逐漸恢復(fù)，8 h后基本恢復(fù)到初始值。因此，添加α2-f（56-57）：YS的發(fā)酵酸奶，具有很好的降高血壓的效果。

3 討論

ACE是一種多功能酶，在動物體內(nèi)的升壓系統(tǒng)腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和降壓系統(tǒng)激肽-激肽釋放酶系統(tǒng)（KKS）中起著重要的調(diào)節(jié)作用，ACE對血壓的作用見圖5。

圖5 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對血壓的調(diào)節(jié)Fig.5 Angiotensin-converting enzyme inhibitors regulation on the blood pressure

血壓的升高是由于該體系的平衡失調(diào)所致。在RAS系統(tǒng)中，當(dāng)人或動物受激動因素的影響時，血漿中或組織中的腎素底物即血管緊張素原（angiotensinogen），在腎素的作用下，血管緊張素原C端失去亮氨酸（Leu），轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ（10肽）（angiotensin，AngⅠ）。在血漿和組織中，特別是在肺循環(huán)血管內(nèi)皮表面存在ACE，Ang I在ACE的作用下，從其C末端去掉His-Leu生成血管緊張素Ⅱ（8肽），這是RAS系統(tǒng)中最強(qiáng)的血管收縮劑，能作用于小動脈，使血管平滑肌收縮，迅速引起升壓效果；與此相反在KKS中舒緩激肽是降壓物質(zhì)，它能舒張毛細(xì)血管增加其通透性，使血壓下降[28-29]，ACE則使舒緩激肽失去C端的Phe-Arg而成為失活片段，引起血壓升高。

因此，在從天然蛋白水解物中是否含有降血壓的產(chǎn)物時，通常采用ACE活性抑制作用進(jìn)行篩選。本文是在前期研究的基礎(chǔ)上，獲得具有ACE活性的酪蛋白水解產(chǎn)物[30-32]，進(jìn)一步分離純化，獲得純化的片段，經(jīng)MS檢測，確定其氨基酸序列為YS（酪氨酸-絲氨酸），經(jīng)過與酪蛋白一級結(jié)構(gòu)的比對，確定為α2-f（56-57）：YS。該片段經(jīng)過體外檢測，具有很好的ACE活性抑制作用（圖1）。經(jīng)過SHR的灌胃實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在灌胃劑量在3 mg/kg mb～9 mg/kg mb具有很好的降血壓效果（圖2），且對正常wistar大鼠的血壓無影響（圖3）。按照動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果（9mg/kgmb），對于人的攝入量，按照60kg體重計(jì)算，每人每天喝100 mL酸奶，在酸奶中添加α2-f（56-57）：YS的量設(shè)計(jì)為60 mg/100 mL。添加該劑量的發(fā)酵酸奶，經(jīng)灌胃SHR實(shí)驗(yàn)，與普通酸奶相比，具有很好的降高血壓的作用（圖4）。

4 結(jié)論

酪蛋白先經(jīng)胃蛋白酶水解，再經(jīng)胰蛋白酶水解，在水解產(chǎn)物中分離獲得的片段α2-f（56-57）：YS，經(jīng)體外和體內(nèi)降壓效果檢測，對原發(fā)性高血壓大鼠具有很好的降血壓的功能，并對正常wistar大鼠的血壓無影響。該片段應(yīng)用于發(fā)酵酸奶中，可制備具有降壓功能的酸奶。

[1]揭紅波.淺談心血管疾病的發(fā)病機(jī)理與預(yù)防[J].中外醫(yī)療,2011, (5):184

[2]陳紹行,沈衛(wèi)峰.高血壓治療現(xiàn)狀[J].國際心血管病雜志,2006, 33(2):67-69

[3]CHOBANIAN A V,BAKRLS G L,BLACK H R,et al.Seventh report of the joint national committee on prevention,detection,evaluation and treatment of high blood pressure[J].Hypertension,2003, 42(2):1206-1252

[4]Guidelines Committee.2003 European Society of Hypertension-European Society of Cardiology guidelines for the management of arterial hypertension[J].Hypertension,2003,21(6):1011-1053

[5]中國高血壓防治指南修訂委員會.2004年中國高血壓防治指南[J].中華心血管病雜志,2004,32(12):1060-1064

[6]張?jiān)?高血壓病的藥物治療新進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2007, 14(3):382-385

[7]張?jiān)词?鄒思湘.酪蛋白源生物活性肽[J].國外畜牧科技,1998,25 (4):33-36

[8]A M Michaelidou.Factors influencing nutritional and health profile of milk and milk products[J].Small Ruminant Research,2008,79: 42-50

[9]MATSUMOTO H,SHIMOKAWA Y,USHIDA Y,et al.New biological function of bovine α-lactalbumin:protective effect against ethanol-and stress-induced gastric mucosal injury in rats[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65(5):1104-1111

[10]MARUYAMA S,SUZUKI H.A peptide inhibitor of angiotensinⅠ-converting enzyme in the tryptic hydrolysate of casein[J].Agric Biol Chem,1982,46(5):1393-1394

[11]KOHMURA M,NIO N,ARIYOSHI Y.Inhibition of angiotensinⅠ-converting enzyme by synthetic peptides of human κ-casein[J].A－gricultural and Biological Chemistry,1990,54(3):825-836

[12]YAMAMOTO N.Antihypertensive peptides derived from food proteins[J].Biopolymers Peptide Science,1997,43(2):129-134

[13]姜瞻梅,田波,吳剛,等.酶解牛乳酪蛋白制備ACE抑制肽的研究[J].中國食品學(xué)報,2007,7(6):39-43

[14]顧瑞霞.乳與乳制品的生理功能特性[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2001:55-58

[15]李朝慧,羅永康,王全宇.乳清蛋白酶解制備ACE抑制肽的研究[J].中國乳品工業(yè),2005,33(2):8-11

[16]FERREIRA I M P L V O,PINHO O,MOTA M V,et al.Preparation of ingredients containing an ACE-inhibitory peptide by tryptic hydrolysis of whey protein concentrates[J].International Dairy Journal, 2007,17(5):481-487

[17]COSTA E L D,GONTIJO J A D,NETTO F M.Effect of heat and enzymatic treatment on the antihypertensive activity of whey protein hydrolysates[J].International Dairy Journal,2007,17(6):632-640

[18]潘道東,郭宇星.瑞士乳桿菌蛋白酶水解乳清蛋白制備ACE抑制肽的條件優(yōu)化[J].食品科學(xué),2009,30(11):138-143

[19]ROKKA T,EEVA L.Release of bioactive peptides by enzymatic proteolysis of Lactobacillus GG fermented UHT milk[J].Milchwissenschaft,1997,52(12):675-677

[20]NAOYUKI Y,ATSUKO A,TOSHIAKI T.Antihypertensive effect of the peptides derived from casein by an extracellular proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J].J Dairy Sci,1994,77:917-922

[21]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. BiochemPharmacol,1971,20:1637-1648

[22]潘道東.抗ACE活性之瑞士乳桿菌的篩選[J].食品科學(xué),2007, 28(2):145-148

[23]王宇.乳酸菌發(fā)酵乳抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性的研究[D].無錫:江南大學(xué),2008

[24]趙樹平,陳永福,孫天松,等.瑞士乳桿菌ND01(L.helveticus ND01)發(fā)酵乳中ACE抑制活性和γ-氨基丁酸的研究[J].中國食品學(xué)報,2009,9(6):48-53

[25]申曉文,牟光慶.酪蛋白源ACE抑制肽的評價方法和研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技,2010,31(9):375-381

[26]CUSHMAN D W,CHEUNG H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J]. Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637-1648

[27]張燕,王紅英,胡艷君,等.SHR大鼠血壓尾套法測定影響因素探討[J].西北藥學(xué)雜志,2008,23(2):34-42

[28]張艷,胡志和.乳蛋白源ACE抑制肽的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué), 2008,29(10):634-640

[29]張美莉.食品功能成分的制備及其應(yīng)用[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2007:111-113

[30]楊銘,胡志和.酪蛋白雙酶水解物ACE抑制肽的分離純化[J].食品科學(xué),2012,33(9):50-53

[31]王佳佳,胡志和.利用電子舌對富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的脫苦評價[J].食品科學(xué),2013,34(4):212-216

[32]王佳佳,胡志和,蔣毅.富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物及其功能性酸奶對SHR血壓的影響[J].食品工業(yè)科技,2013,34(10): 345-356

Inhibition Effect of α2-（f56-57）：YS on ACE Activity and Its Application in Yoghourt

SUN Zhen-gang1，WU Wen-qi1，F(xiàn)ENG Yong-qiang1，HU Zhi-he2，*，ZHAO Yong2
（1.Tianjin Haihe Dairy Co.，Ltd.，Tianjin 300402，China；2.Tianjin Key Laboratory of Food and Biotechnology，College of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Objective of this research was to evaluate inhibition effect of α2-f（56-57）：YS，which from milk α2-casein，on ACE（angiotensin converting enzyme）activity，and its antihypertensive efficacy.And it was applied to produce yoghourt，which had antihypertensive efficacy.The inhibition effect of α2-f（56-57）：YS on ACE activity was evaluated using spectrophotometric method.The antihypertensive efficacy of α2-f（56-57）：YS and the yoghourt which contain α2-f（56-57）：YS was evaluated by gavage SHR（pontaneously hypertensive rat）in different dose.Results showed that α2-f（56-57）：YS had good inhibition effect on ACE activity in vitro，and its median inhibitory concentration（IC50）was 11.89 μg/mL.SHR was given α2-f（56-57）：YS in different dose（1，3，9 mg/kg mb）by gavage，after given 4 hour，the blood pressure of SHR was reduced 18.25，31.38 and 36.88 mm Hg，respectively，and it was return to the initial blood pressure values after given 8 hour.SHR was given the yoghourt of containing α2-f（56-57）：YS in 10 mL/kg mbby gavage，after given 4 h，its SBP was reduced 32.5 mm Hg，and after given 8 h，the SBP return to the initial value.Therefore，α2-f（56-57）：YS had antihypertensive efficacy，and applied it in yoghurt，could give the yoghourt antihypertensive efficacy.

ACE inhibitory peptides；α2-f（56-57）：YS；fermented yoghourt；antihypertensive efficacy

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.002

天津市科技支撐項(xiàng)目（14ZCZDNC00017）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14JCZDJC34500）

孫振剛（1969—），男（漢），獸醫(yī)師，學(xué)士，本科，研究方向：乳品加工。

*通信作者：胡志和（1962—），男，教授，碩士，研究方向：專用功能食品。

2014-12-08