胡琳，祖茂衡，華淺近，王丹

血管內皮細胞增殖過程中碘離子與MEK1表達及磷酸化關系的研究

胡琳，祖茂衡，華淺近，王丹

目的研究血管內皮細胞（VEC）增殖過程中碘離子（I-）與絲裂原活化蛋白激酶1（MEK1）表達及其磷酸化的關系，探討高碘促VEC增殖效應的作用通路。方法①將體外培養(yǎng)的VEC分為空白對照組和不同碘離子濃度的實驗組。②采用蛋白質印跡技術（Western blot）檢測不同碘離子濃度培養(yǎng)環(huán)境中MEK1蛋白表達量及磷酸化水平。結果①在300 μg/L碘離子濃度組，MEK1蛋白相對表達量高于其他組（P＜0.05）。②500 μg/L、1 000 μg/L碘離子濃度可促進MEK1（Ser298位點）磷酸化水平上調（P＜0.05）。③各實驗組MEK1（Thr286位點）磷酸化水平下調（P＜0.05）。結論碘促VEC增殖可能與胞外信號調節(jié)激酶（ERK）通路的激活有關。

布加綜合征；血管內皮細胞；碘離子

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between iodine ion and the expression of both MEK1 and its phosphorylation during the course of vascular endothelial cell（VEC）proliferation，and to explore the pathway of the promoting effect of iodine ion on VEC proliferation.Methods①The vascular endothelial cells cultured in vitro were divided into the control group（without any treatment）and four KI groups（treated with 100 μg/L KI，300 μg/L KI，500 μg/L K and 1 000 μg/L KI，respectively）.②The effects of iodine ion concentration（100 μg/L，300 μg/L，500 μg/L and 1 000 μg/L，respectively）on the expression of MEK1 and its phosphorylation were determined using Western Blot method.Results①The expression of MEK1 in 300 μg/L KI group was higher than that in other groups（P＜0.05）.②The MEK1 phosphorylation levels at Ser298 site in iodine ion concentration of 500 μg/L and 1 000 μg/L groups were significantly increased（P＜0.05）.③The MEK1 phosphorylation levels at Thr286 site in all different iodine ion concentration groups were significantly decreased（P＜0.05）.ConclusionThe promotion effect of iodine ion on vascular endothelial cell proliferation is related to the activation of extracellular signal-regulated kinase（ERK）signal transduction.（J Intervent Radiol，2015，24：150-153）

【Key words】Budd-Chiari syndrome；vascular endothelial cell；iodine ion

我國布加綜合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）以下腔靜脈隔膜阻塞型（membranous obstruction ofthe inferior vene cava，MOVC）為主，其特征是下腔靜脈和（或）肝靜脈開口處隔膜形成。病理學研究發(fā)現(xiàn)隔膜組織主要由血管內皮和纖維組織構成［1-2］。同時流行病學研究顯示該型患者分布與水源性高碘地區(qū)分布相符［3］。針對碘離子（I-）與血管內皮細胞（VEC）增殖的關系，研究顯示碘不促進VEC合成血管內皮生長因子（VEGF）［4］，且高碘環(huán)境未誘導VEGF受體（VEGFR）與VEC增殖有關的位點磷酸化改變［5］。但細胞增殖檢測顯示碘促VEC增殖可能與MEK1激活有關［6］，提示高碘促VEC增殖效應可能發(fā)生于細胞質。

本研究在體外用不同濃度I-培養(yǎng)VEC，檢測MEK1的表達及調控增殖相關位點Ser298、Thr286的磷酸化水平，探討高碘促VEC增殖效應的作用通路。

1　材料與方法

1.1細胞株培養(yǎng)

EA.hy926人臍靜脈內皮細胞融合細胞（目錄號GNHu39）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。細胞培養(yǎng)于Corning培養(yǎng)皿中，使用DMEM高糖培養(yǎng)基（GIBCO公司），加10%胎牛血清（GIBCO公司），置于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細胞貼壁生長匯合即可傳代。

1.2檢測方法

Western blot檢測絲裂原活化蛋白激酶1（MEK1）蛋白表達及磷酸化：取對數(shù)生長期內皮細胞1∶5傳代，常規(guī)培養(yǎng)至70%細胞匯合，再以不加血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。隨后根據(jù)加入濃度不同I-，將細胞分5組：①空白對照組，直接使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；②高碘組，向DMEM培養(yǎng)基中分別加入碘化鉀，使I-終濃度分別為100、300、500和1 000 μg/L。再將細胞于培養(yǎng)箱中孵育12 h。用冰PBS洗滌3次，每個皿中加入80 μl含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA法測蛋白濃度并分裝。取等量樣品加入上樣緩沖液煮沸5 min后上樣、電泳、轉膜和免疫反應。MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）一抗均以1∶1 000稀釋，二抗稀釋比亦為1∶1 000。顯色方法為5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑藍（BCIP/NBT）發(fā)色顯色法。以上條帶均以β-actin作為內參照。掃描后采用IPP6.0圖像分析軟件對特異性條帶進行半定量分析，以MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）各自與β-acting的灰度值的比值評定MEK1及p-MEK1（Ser298、Thr298）蛋白表達水平。以上實驗重復3次。

1.3統(tǒng)計學方法

用SPSS16.0軟件行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多組之間兩兩比較采用LSD法或Tamhane's T2法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1I-對MEK1蛋白表達的影響

各碘濃度組與空白組比較，300 μg/L組MEK1蛋白相對表達量較空白對照組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1　不同濃度碘環(huán)境中MEK1總蛋白及Ser298、Thr286位點磷酸化蛋白的表達

圖1　MEK1、p-MEK1（Ser298）、p-MEK1（Thr286）在各組中的表達

2.2I-對Ser298位點磷酸化的影響

與空白對照組比較，500 μg/L組和1 000 μg/L組的MEK1（Ser298）蛋白磷酸化水平上調（P＜0.05），500 μg/L組和1 000 μg/L組的組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3I-對Thr286位點磷酸化的影響

各離子組與空白對照組比較，MEK1（Thr286）蛋白磷酸化水平下調（P＜0.05）；碘濃度300 μg/L組、500 μg/L組、1 000 μg/L組與100 μg/L組比較，磷酸化水平下調（P＜0.05）；300 μg/L組、500 μg/L組、1 000 μg/L組組間兩兩比較，僅500μg/L組較300 μg/L組磷酸化水平下調，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3　討論

3.1I-與VEC增殖作用及增殖途徑的探討

與國外不同，我國BCS患者以MOVC型多見，隔膜由不含彈性蛋白的纖維組織表面覆蓋內皮細胞構成［7］，并與下腔靜脈管壁相延續(xù)［1］。國內流行病學調查顯示MOVC型患者分布與水源性高碘地區(qū)分布相符，患者尿碘水平亦高于正常人［3］。目前研究顯示患者血清中碘含量明顯高于正常人（未發(fā)表資料）。在體外培養(yǎng)VEC發(fā)現(xiàn)一定濃度的I-能夠促進其增殖［8-9］，我們認為I-可能是引起下腔靜脈隔膜形成的重要因素之一。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)MOVC型BCS患者下腔靜脈血中VEGF含量明顯高于非BCS對照組［10］，但體外高碘培養(yǎng)的VEC并未出現(xiàn)VEGF的高表達［4］，且I-對細胞膜受體VEGFR-2的總表達量無影響，同時介導細胞增殖的VEGFR-2 Tyr1175位點的磷酸化水平未出現(xiàn)上調［5］，提示I-促VEC增殖效應不依賴于VEGF和VEGFR的高表達。VEC增殖檢測發(fā)現(xiàn)I-促增殖效應可能與MEK1的激活有關［6］，以此為切入點，我們推測I-可能直接作用于細胞質，激活ERK通路引起細胞增殖效應。

ERK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的一員，是調節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂的信號網(wǎng)絡的樞紐。Ras/Raf-1/ MEK1/ERK1/2是ERK通路的主要途徑［11］，Raf-1是MAPK級聯(lián)反應的啟動蛋白，一旦被上游蛋白Ras激活，可與MEK1結合并使之磷酸化，活化的MEK1連接并激活ERKs，ERKs進入細胞核，直接激活大量的轉錄因子［12］，發(fā)揮細胞增殖效應。

3.2I-與MEK1、p-MEK1（Ser298、Thr286）蛋白表達的關系及意義

MEK1是調控ERK通路級聯(lián)反應的核心，300 μg/L組的MEK1蛋白高表達，提示I-可能通過提高MEK1的蛋白表達量來發(fā)揮VEC增殖效應。其激活是通過磷酸化實現(xiàn)的，MEK1存在多個磷酸化位點，其中兩個重要位點Ser298和Thr286的磷酸化對MEK1活性的影響截然不同，并對隨后的酶促級聯(lián)反應有不同的調控作用。

本研究的Western blot結果顯示，I-濃度500 μg/ L組和1 000 μg/L組較對照組的Ser298位點磷酸化水平明顯上調，提示高濃度I-能讓Ser298位點的磷酸化水平上調。碘對體外培養(yǎng)的VEC有刺激增殖的作用，這種作用與I-濃度及作用時間有關，高濃度I-組細胞數(shù)量及細胞活性明顯升高所需的作用時間短于低濃度I-組，低濃度I-組需延長作用時間才顯示出細胞數(shù)量及活性的明顯升高［9］，高碘對VEC的作用呈現(xiàn)出劑量-時間-效應關系。鑒于本實驗中I-作用12 h后即提取各組蛋白以備用，我們推測100和300 μg/L組在延長培養(yǎng)時間后Ser298的磷酸化水平也較對照組上調。位點Ser298位于MEK1第Ⅸ至Ⅹ催化區(qū)之間的多聚脯氨基序列中，Ser298的磷酸化可最大化Raf-1和MEK1的結合作用，并增強MEK1的活化［13］?；罨腗EK1通過其N端區(qū)域與ERKs直接連接，催化ERK的亞功能區(qū)8“TEY盒”中的Tyr和Thr殘基雙特異性磷酸化，激活ERK，隨后發(fā)揮細胞增殖效應。MEK1不僅僅是ERK的激活物，還可能是ERK在胞質中的錨定器，當信號通路無活性時，它將ERK固定在胞質中，一旦有信號刺激ERKs磷酸化及二聚體化，可激活ERKs并將其轉移到胞核或其他活化位點，再進一步磷酸化下游底物。

與對照組比較，各實驗組Thr286磷酸化水平下調；與100 μg/L組比較，300、500和1 000 μg/L組Thr286磷酸化水平下調；500 μg/L組較300 μg/L組Thr286磷酸化水平下調。Thr286的磷酸化直接滅活MEK1［14］，引起隨后MEK1和ERK的解偶聯(lián)［15］，從而使MAPK級聯(lián)反應終止。所以在細胞周期中，Thr286可能是終止細胞有絲分裂的調控點［14］。本研究中，各實驗組較對照組的差異及實驗組組間的差異提示I-可引起MEK1（Thr286）磷酸化水平的下調，并且在一定濃度范圍內，隨著I-濃度的增高，ERK通路的負向調控作用逐漸減弱。

綜上所述，本研究通過I-促VEC增殖的作用通路，探討MOVC型BCS的可能發(fā)病機制，本研究中發(fā)現(xiàn)不同濃度I-可以促進MEK1蛋白高表達及MEK1（Ser298、Thr286）的磷酸化水平改變，提示I-促VEC增殖效應最終是通過ERK通路的激活來實現(xiàn)的。但本研究不能確定I-是否直接作用于MEK1，且100 μg/L組與300 μg/L組延長I-培養(yǎng)細胞時間是否能上調Ser298位點的磷酸化水平需跟進觀察。作為MAPK家族成員，ERK通路與其他的細胞內信息傳遞通路相互聯(lián)系和作用，是調節(jié)細胞生長、發(fā)育及分裂的信息網(wǎng)絡的中樞，其各級酶促級聯(lián)反應易受其他通路及各種細胞因子的調控，I-促VEC增殖效應是否經(jīng)其他通路激活ERK通路也有待進一步研究。

［1］王佾，張輝，郭成浩，等.下腔靜脈隔膜阻塞型布-加綜合征的病理學及病因學研究［J］.介入放射學雜志，2008，17：500-503.

［2］白衛(wèi)星，李天曉，翟水亭，等.布-加綜合征隔膜組織病理學與相關因素研究［J］.介入放射學雜志，2008，17：463-467.

［3］肖培瑞，藺新英，郭成浩，等.布-加綜合征分布與飲用水碘含量關系研究［J］.環(huán)境與健康雜志，2010，27：618-620.

［4］李鵬飛，騰飛，莊銀萍，等.碘對血管內皮細胞表達VEGF影響的研究［J］.徐州醫(yī)學院學報，2012，32：442-444.

［5］滕飛，祖茂衡，華淺近，等.血管內皮細胞增殖過程中碘離子與血管內皮生長因子及其受體的關系［J］.介入放射學雜志，2013，22：403-408.

［6］李鵬飛，騰飛，莊銀萍，等.碘促進血管內皮細胞增殖作用與MEK1相關性及碘對血管內皮細胞表達VEGF影響的實驗研究［J］.當代醫(yī)學，2012，18：13-15.

［7］Riemens SC，Haagsma EB，Kok T，et al.Familial occurrence of membranous obstruction of the inferior vena cava:arguments in favor of a congenital etiology［J］.J Hepatol，1995，22:404-409.

［8］王曉磊，徐麗雅，張海濤，等.不同碘濃度對培養(yǎng)血管內皮細胞增殖的影響［J］.山東大學學報：醫(yī)學版，2007，45：310-312.

［9］劉倫，焦波，郭成浩.碘伏對血管內皮細胞增殖的影響［J］.山東醫(yī)藥，2007，47：46-47.

［10］韓新強，祖茂衡.VEGF在下腔靜脈隔膜型布-加綜合征患者中異常表達的意義分析［J］.當代醫(yī)學，2010，16：672-674.

［11］趙明哲，劉靖華，李玉花，等.ERK信號通路的信號轉導調控機制［J］.國際病理科學與臨床雜志，2009，29：15-19.

［12］Coles LC，Shaw PE.PAK1 primes MEK1 for phosphorylation by Raf-1 kinase during cross-cascade activation of the ERK pathway［J］.Oncogene，2002，21:2236-2244.

［13］Frost JA，Steen H，Shapiro P，et al.Cross-cascade activation of ERKs and ternary complex factors by Rho family proteins［J］. EMBO J，1997，16:6426-6438.

［14］Sharma P，Sharma M，Amin ND，et al.Phosphorylation of MEK1 by cdk5/p35 down-regulates the mitogen-activated protein kinase pathway［J］.J Biol Chem，2002，277:528-534.

［15］Ramos-Miguel A，García-Sevilla JA.Crosstalk between cdk5 and MEK-ERK signalling upon opioid receptor stimulation leads to upregulation of activator p25 and MEK1 inhibition in rat brain［J］.Neuroscience，2012，215:17-30.

The relationship between iodine ion and the expression of both MEK1 and its phosphorylation duringthe course of vascular endothelial cell proliferation

HU Lin，ZU Mao-heng，HUA Qian-jin，WANG Dan.Department of Interventional Radiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou，Jiangsu Province 221002，China

ZU Mao-heng，E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com

R543.5

A

1008-794X（2015）-02-0150-04

2014-07-09）

（本文編輯：李欣）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.02.015

江蘇省科技創(chuàng)新與成果轉化專項基金資助項目（BL2012021）

221002江蘇徐州徐州醫(yī)學院附屬醫(yī)院介入放射科

祖茂衡E-mail：cjr.zumaoheng@vip.163.com