王棟，宮衛(wèi)東，黃辭，李中華，劉振堂，吳智群

MS-275對胃腺癌細胞抑制作用及其機制研究

王棟，宮衛(wèi)東，黃辭，李中華，劉振堂，吳智群

目的采用分子靶向藥物治療胃癌是近年研究熱點。探討組蛋白去乙酰化酶抑制因子MS-275通過多種途徑選擇性殺傷人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901的機制。方法10～100 μmol/L藥物濃度梯度的MS-275分別與SGC-7901、人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1共培養(yǎng)24 h后，采用WST-1法檢測SGC-7901及GES-1細胞存活率，流式細胞儀檢測分析SGC-7901細胞線粒體膜電位變化，Western blot、實時熒光定量聚合酶鏈反應（RTQ-PCR）分別檢測處理后胃癌細胞中p21、p27、p57、cyclin B1、cyclin D1基因及相應蛋白表達情況。結果MS-275可使SGC-7901細胞存活率降低（P＜0.05），其作用隨藥物濃度增大更明顯，對GES-1細胞無顯著影響；MS-275可降低SGC-7901細胞線粒體膜電位（P＜0.05）；MS-275顯著提升p21、p27、p57基因及相應蛋白相對含量，同時降低cyclin B1、cyclin D1基因及其蛋白相對含量（P＜0.05）。結論MS-275可選擇性殺傷胃腺癌細胞SGC-7901，這一作用可能是通過線粒體凋亡途徑及調控細胞周期相關基因和蛋白表達實現(xiàn)的。

MS-275；胃腺癌；SGC-7901；線粒體凋亡；細胞周期阻滯

胃癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，在全球范圍內的發(fā)病率很高［1］。胃癌發(fā)病機制復雜，涉及多種因素、多個病理過程。研究表明，胃癌發(fā)生與核小體核心組蛋白N端賴氨酸殘基乙?；腿ヒ阴；Ш庥兄芮嘘P系［2］。組蛋白去乙?；敢种埔蜃樱℉DACi）通過調節(jié)組蛋白乙?；腿ヒ阴；?，發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長、促進腫瘤細胞凋亡的作用，并且對正常組織的不良反應較?。?-5］。MS-275系人工合成的苯甲酰胺類HDACi，前期研究表明其對胃腺癌細胞具有選擇性殺傷作用，但具體機制尚不十分清楚［6-7］。本研究旨在前期研究基礎上，深入探究MS-275對人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901選擇性殺傷的作用機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901和人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1由第四軍醫(yī)大學細胞生物中心提供，MS-275購自德國Merck公司，RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶及胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，WST-1試劑盒及ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒購自北京泛博生物技術公司，所用PCR引物購自北京奧科鼎盛生物科技有限公司。

1.2SGC-7901、GES-1細胞培養(yǎng)

SGC-7901細胞在含10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，GES-1細胞在含10%胎牛血清、100 mg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)；所有細胞均在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天換液1次，鋪滿培養(yǎng)瓶底面積85%以上即可傳代，傳代時PBS緩沖液洗滌3次，0.25%胰酶消化1 min，一般按1∶3傳代。

1.3細胞存活率檢測

分別取對數(shù)生長期GES-1和SGC-7901細胞，用胰酶消化后吹打成單細胞懸液，以1×105/ml細胞濃度接種于96孔板（每孔100 μl，實驗組），以不含細胞的培養(yǎng)基為空白對照（對照組），培養(yǎng)過夜。待細胞充分貼壁，加入MS-275，終濃度分別設置為10、20、40、60、80 μmol/L，每個濃度3個平行孔；對照組不加MS-275。培養(yǎng)24 h后取出，每孔加入10 μl WST-1檢測液，37℃溫箱中溫育4 h后酶標儀450 nm測定吸光值（D），空白對照孔調零后根據(jù)吸光值結果計算腫瘤細胞存活率：腫瘤細胞存活率（%）=D實驗組/D對照組×100%。

1.4線粒體膜電位檢測

分別取SGC-7901細胞和GES-1細胞，用20～80 μmol/L MS-275作用24 h，PBS緩沖液洗滌2次后，按照JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作。用流式細胞儀進行分析，JC-1單體和聚合物熒光信號分別在FL1和FL2探測器上獲得，F(xiàn)L1-H、FL2-H分別代表綠色熒光強度和紅色熒光強度。

1.5Western blot檢測p21、p27等蛋白表達

用三去污試劑從SGC-7901細胞中提取總蛋白，分別采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對p21、p27、p57、cyclin B1、cyclin D1進行分離，然后轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%牛奶室溫下?lián)u動封閉后加入一抗，4℃過夜；室溫下洗膜后加入二抗，用ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。

1.6實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測

采用Trizol試劑提取細胞總RNA，反轉錄獲得cDNA，然后作實時熒光定量聚合酶鏈反應（RTQPCR）檢測，并分析檢測結果；對待測樣品目的基因進行定量，并用管家基因GAPDH進行校正?；驍U增引物及條件見表1。

表1　基因擴增引物及條件

1.7統(tǒng)計學分析

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，多組間兩兩比較用單向方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1MS-275可選擇性降低SGC-7901細胞存活率

WST-1檢測結果顯示，實驗組HDACi MS-275能夠明顯降低人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901存活率，且這種作用具有濃度依賴性，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。然而，在相同條件下，人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1存活率并未隨MS-275濃度升高出現(xiàn)明顯降低（P＞0.05）（圖1）。MS-275對SGC-7901細胞作用24 h的IC50約為80 μmol/L。

2.2MS-275可降低SGC-7901細胞線粒體膜電位

線粒體膜電位變化用流式細胞儀和JC-1試劑盒進行檢測。JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位（Δψm）的理想熒光探針。線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物，可產生紅色熒光；線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質中，此時JC-1為單體，可產生綠色熒光。由圖2可看出，實驗組紅色熒光強度與綠色熒光強度比值較對照組降低，且具有濃度依賴性，說明MS-275降低了SGC-7901細胞的線粒體膜電位；但在MS-275濃度為80μmol/L時，線粒體膜電位出現(xiàn)升高。2.3MS-275對SGC-7901細胞周期的影響

圖1　MS-275對不同細胞生存率的影響

圖2　流式細胞儀分析MS-275對SGC-7901細胞體膜電位的影響

Western blot檢測顯示，MS-275能不同程度地上調SGC-7901細胞周期p21、p27、p57蛋白表達，同時下調cyclin B1、cyclin D1蛋白表達（圖3）。

2.4MS-275對腫瘤相關基因mRNA水平的影響

隨著MS-275作用濃度增高，p21、p27及p57相對含量逐漸升高，cyclin B1、cyclin D1相對含量逐漸降低（圖4），各數(shù)據(jù)間均有顯著性差異（P＜0.05）。

圖3　MS-275處理24 h后SGC-7901細胞中腫瘤相關蛋白表達變化

3　討論

MS-275作為一種人工合成的苯甲酰胺類HDACi，可通過抑制組蛋白去乙?；富钚?，使靶細胞內組蛋白高度乙酰化，從而使細胞核內染色質結構疏松，并通過影響多種特異性基因表達調控細胞凋亡途徑，發(fā)揮腫瘤殺傷作用［8-9］。前期大量實驗證明，MS-275的腫瘤殺傷作用具有選擇性，即它可以顯著抑制腫瘤細胞生長，而對正常細胞沒有影響［10-11］。

圖4　MS-275對SGC-7901細胞中腫瘤相關基因表達的影響

我們課題組前期研究證實，MS-275可明顯抑制人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901增殖，并具有時間及劑量依賴性，但對人正常胃黏膜上皮細胞株GES-l和張氏肝細胞株卻沒有致凋亡作用，即MS-275對胃癌細胞具有選擇性殺傷作用［6］；實驗結果顯示，MS-275濃度在1～8 μmol/L范圍內作用24 h，胃癌細胞存活率雖有下降，但并不具有顯著性差異；細胞存活率實驗證明，將MS-275濃度調至10 μmol/ L作用24 h，胃癌細胞存活率為64.50%，出現(xiàn)明顯的細胞增殖抑制效應，隨著藥物濃度逐漸增高，細胞存活率不斷下降，在80 μmol/L時細胞存活率降至49.79%，說明MS-275對SGC-7901細胞的增殖抑制效應不斷增強。為此，我們在本研究中將MS-275濃度范圍提升至10～100 μmol/L。

我們通過檢測MS-275作用前后線粒體膜電位變化發(fā)現(xiàn)，MS-275可使SGC-7901細胞線粒體膜電位下降，且這種作用具有濃度依賴性，提示MS-275經由線粒體途徑誘導SGC-7901細胞凋亡。這與Meng等［12］報道HDACi制滴菌素A（trichostatin A，TSA）對結腸直腸癌的作用，Rosato等［13］報道MS-275對白血病細胞的作用相一致。但MS-275在作用濃度為80 μmol/L時，線粒體膜電位出現(xiàn)了升高，這可能與高濃度MS-275對SGC-7901的直接毒性作用有關。

我們前期研究表明，MS-275具有阻滯細胞周期的作用，可誘導SGC-7901細胞停滯于G1/S期［6］。本研究進一步發(fā)現(xiàn)，MS-275能顯著增加SGC-7901細胞內p21、p27及p57蛋白量，同時降低cyclin B1、cyclin D1蛋白量；RTQ-PCR檢測顯示MS-275提高了p21、p27及p57基因的相對含量，同時降低了cyclin B1、cyclin D1的相對含量，且作用均具有濃度依賴性。p21、p27、p57、cyclin B1及cyclin D1是重要的細胞周期調控蛋白，參與細胞生長、分化、衰老及死亡過程，同時與腫瘤發(fā)生密切相關。p21、p27及p57同屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDKI），可通過抑制cyclin-細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）活性來調控細胞周期，并可直接結合增殖細胞核抗原（PCNA）抑制細胞DNA合成，導致細胞停滯在G1期，阻止細胞周期分裂［14］。cyclin B1、cyclin D1基因是重要的原癌基因，它們的蛋白產物分別在G2/M期和G1早期發(fā)揮促細胞增殖的正向調控作用［15］。MS-275作用后p21、p27、p57基因及它們的蛋白表達產物相對含量提高，提示MS-275通過上調CDKI使SGC-7901細胞停滯于G1/S期，從而發(fā)揮殺傷作用。同時，MS-275可通過下調cyclin B1、cyclin D1抑制SGC-7901細胞增殖。這與Zhou等［16］報道HDACi辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA）及丁酸鈉（SB）對成熟神經干細胞的作用，吳偉琪等［17］報道HDACi TSA對胃癌細胞的作用相一致。

綜上所述，MS-275可通過線粒體凋亡途徑及調控細胞周期相關基因和蛋白的表達發(fā)揮對人胃低分化腺癌細胞株SGC-7901的生長抑制作用及選擇性殺傷作用。MS-275對人胃低分化腺癌細胞的作用機制復雜，尚需進行后續(xù)實驗深入研究。進一步揭示MS-275抗胃癌機制，有利于為胃癌治療提供新途徑。

［1］Thrumurthy SG，Chaudry MA，Hochhauser D，et al.The diagnosis and management of gastric cancer［J］.BMJ，2013，347:f6367.

［2］Sun WJ，Zhou X，Zheng JH，et al.Histone acetyltransferases and deacetylases:molecular and clinical implications to gastrointestinal carcinogenesis［J］.Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2012，44:80-91.

［3］Bose P，Dai Y，Grant S.Histone deacetylase inhibitor（HDACI）mechanisms of action:Emerging insights［J］.Pharmacol Ther，2014，143:323-336.

［4］Ververis K，Hiong A，Karagiannis TC，et al.Histone deacetylase inhibitors（HDACIs）:multitargeted anticancer agents［J］.Biologics，2013，7:47-60.

［5］Batty N，Malouf GG，Issa JP.Histone deacetylase inhibitors as anti-neoplastic agents［J］.Cancer Lett，2009，280:192-200.

［6］劉瑾，任亞蟬，吳智群.組蛋白去乙?；敢种苿㎝S-275在體外抑制胃癌細胞的實驗研究［J］.中國癌癥雜志，2011，21：585-588.

［7］Zhang Y，Adachi M，Zhao X，et al.Histone deacetylase inhibitors FK228，N-（2-aminophenyl）-4-［N-（pyridin-3-yl-metho-xycarbonyl）amino-methyl］benzamide and m-carboxycinnamic acid bishydroxamide augment radiation-induced cell death in gastrointestinal adenocarcinoma cells［J］.Int J Cancer，2004，110:301-308.

［8］Bose P，Dai Y，Grant S.Histone deacetylase inhibitor（HDACI）mechanisms of action:emerging insights［J］.Pharmacol Ther，2014，143:323-336.

［9］Hess-Stumpp H，Bracker TU，Henderson D，et al.MS-275，a potent orally available inhibitor of histone deacetylases:the development of an anticancer agent［J］.Int J Biochem Cell Biol，2007，39:1388-1405.

［10］Baradari V，H?pfner M，Huether A，et al.Histone deacetylase inhibitor MS-275 alone or combined with bortezomib or sorafenib exhibits strong antiproliferative action in human cholangiocarcinoma cells［J］.World J Gastroenterol，2007，13:4458-4466.

［11］Larsson C.Epigenetic aspects on therapy development for gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors［J］.Neuroendocrinology，2013，97:19-25.

［12］Meng J，Zhang HH，Zhou CX，et al.The histone deacetylase inhibitor trichostatin A induces cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cells via p53-dependent and-independent pathways［J］.Oncol Rep，2012，28:384-388.

［13］Rosato RR，Almenara JA，Grant S.The histone deacetylase inhibitor MS-275 promotes differentiation or apoptosis in human leukemia cells through a process regulated by generation of reactive oxygen species and induction of p21CIP1/WAF1 1［J］. Cancer Res，2003，63:3637-3645.

［14］Bonelli P，Tuccillo FM，Borrelli A，et al.CDK/CCN and CDKI alterations for cancer prognosis and therapeutic predictivity［J］. Biomed Res Int，2014:361020.

［15］Mani S，Wang CG，Wu KM，et al.Cyclin-dependent kinase inhibitors:novel anticancer agents［J］.Expert Opin Investig Drugs，2000，9:1849-1870.

［16］Zhou Q，Dalgard CL，Wynder C，et al.Histone deacetylase inhibitors SAHA and sodium butyrate block G1-to-S cell cycle progression in neurosphere formation by adult subventricular cells［J］.BMC Neurosci，2011，12:50.

［17］吳偉琪，施敏，王玉剛，等.曲古霉素A對人胃癌細胞的抑制作用及其機制探討［J］.胃腸病學，2013，18：143-148.

Inhibitory effect of MS-275 on gastric glandular cancer cells and its possible mechanism

WANGDong，GONG Wei-dong，HUANG Ci，LI Zhong-hua，LIU Zhen-tang，WU Zhi-qun.Department of Interventional Radiology，Tangdu Hospital，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi'an，Shaanxi Province 710038，China

WU Zhi-qun，E-mail：zhiqunwu@aliyun.com

ObjectiveThe use of targeting therapy for the treatment of gastric glandular cancer has been a hot topic in recent years.This study aims to clarify that through what ways the histone deacetylase inhibitor MS-275 completes its selectively killing effect on gastric glandular cancer cell line SGC-7901.Methods SGC-7901 cells and GES-1 cells were respectively cultured for 24h，with（10-100）μmol/L concentrations of MS-275.（1）The survival rate of SGC-7901 cells，GES-1 cells and the normal cells were analyzed by WST-1；（2）The change of the mitochondrial membrane potential in SGC-7901 was estimated by flow cytometry；（3）The expression levels of p21，p27，p57，cyclinB1，cyclinD1 were determined by Western blot and PCR methods.Results（1）MS-275 could decrease the survival rate of SGC-7901 cells，the effect was significantly enhanced with the increasing of the concentration（P＜0.05），but MS-275 showed no obvious effect on normal gastric mucosa epithelial cells GES-1；（2）MS-275 treatment could decreased the mitochondrial membrane potential of SGC-7901 cells（P＜0.05）；（3）MS-275 treatment could increase the relative contents of p21，p27，p57 genes and their protein and，at the same time，decrease the relative contents of CyclinB1 and CyclinD1（P＜0.05）.ConclusionMS-275 treatment can selectively kill gastric glandular cancer cells SGC-7901 through several possible ways，such as inducing mitochondrial apoptosis and regulating the expression levels of cell cycle-related genes and proteins.（J Intervent Radiol，2015，24：333-337）

MS-275；gastric glandular cancer；SGC-7901；mitochondrial apoptosis；cell-cycle arrest

R735.2

A

1008-794X（2015）-04-0333-05

2014-09-04）

（本文編輯：邊佶）

10.3969/j.issn.1008-794X.2015.04.014

國家自然科學基金（30973464）

710038西安第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院介入科

吳智群E-mail：zhiqunwu@aliyun.com