葛文亮，胥傳來

（1.無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇無錫214002；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

生物素間接競爭酶聯(lián)免疫方法的建立

葛文亮1，胥傳來2

（1.無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇無錫214002；2.江南大學食品學院，江蘇無錫214122）

利用不同方法合成的生物素免疫原免疫小鼠，利用所得到的單克隆抗體建立針對生物素的間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法。所建立的間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法對生物素具有良好的特異性與較高的靈敏度，其對生物素半抑制率質(zhì)量濃度為2.01 ng/mL，最低檢測限為0.32 ng/mL，并且對液態(tài)奶、奶粉等樣品中的生物素含量具有準確的檢出性。與國標相比，所建立的間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法具有結(jié)果穩(wěn)定，操作方便和高靈敏度高特異性等優(yōu)點，對實際樣品的檢測具有重要意義。

乳制品；生物素；間接競爭酶聯(lián)吸附測定法

生物素，又被稱為輔酶R、維生素B7、維生素H以及W因子［1］，屬于水溶性B族維生素中的一種。作為參與蛋白質(zhì)、脂肪與碳水化合物代謝過程的一個必不可少的輔助因子，生物素是影響動植物生長發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)，在生物體的各種活動中扮演著十分重要的角色［2］。

盡管生物素對人體的生長，發(fā)育和健康有著十分重演的作用，但人體并不能自身合成這種維生素，而只能從日常飲食中攝取，例如蛋黃、動物內(nèi)臟、一些蔬菜和乳制品，一些腸道微生物也可以幫助人體進行合成［3-4］。

一般人群很少會出現(xiàn)生物素缺乏的情況，只有少數(shù)生物酶缺乏人群［5］，腸炎患者［6］以及大量酗酒者［7］會出現(xiàn)生物素缺乏的現(xiàn)象。生物素缺乏會導(dǎo)致皮膚干燥、皮疹、毛發(fā)無光澤。有動物實驗已經(jīng)證明孕期生物素缺乏會導(dǎo)致胚胎生長遲緩，胎兒先天性畸形與死亡［8］。特別是嬰幼兒，由于腸道功能較弱而容易導(dǎo)致生物素缺乏現(xiàn)象，可能會引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)病癥，甚至于嬰幼兒的猝死［8］。因此，在嬰幼兒食品中添加一定量的生物素是十分必要的［9］。

儀器檢測方法和微生物學鑒定法，都是常用的生物素檢測方法。儀器檢測方法雖然結(jié)果準確但存在樣品準備過程復(fù)雜繁瑣，需要專業(yè)人員操作等弊端。微生物學鑒定法檢測結(jié)果靈敏，并且在世界范圍內(nèi)廣泛使用，屬于各國檢測的標準方法。但是微生物菌株的活性在傳代過程中會發(fā)生變化，而且試劑盒價格高昂，很難得到大范圍的推廣。

酶聯(lián)免疫方法（ELISA）是一基于抗原-抗體反應(yīng)的簡便，靈敏，價格低廉的檢測方法，將會成為一種食品中生物素含量快速檢測的理想方法［10］。

在作者的研究中，生物素被耦聯(lián)在不同的載體蛋白表面，分別作為免疫原與包被原使用。通過小鼠免疫與脾臟融合過程獲得了針對生物素的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了間接競爭酶聯(lián)免疫方法（Ic-ELISA），可將其應(yīng)用于乳制品中的生物素含量的檢測。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

生物素，生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯（Biotin-NHS），以及其余維生素標準品，6-氨基己酸（6-ACA），牛血清白蛋白（BSA），雞卵白蛋白（OVA），碳化二亞胺（EDC），氮羥基琥珀酸（NHS），弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），明膠：購于Sigma公司；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠IgG：康成生物工程公司產(chǎn)品；其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2主要儀器

Thermo MK3酶標儀：熱電公司產(chǎn)品；伯樂電泳槽與電泳儀：伯樂公司產(chǎn)品；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；高吸附性96孔酶標板：無錫國盛生物工程有限公司產(chǎn)品；FR-980A生物電泳圖像分析系統(tǒng)：上海復(fù)日科技有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.1生物素免疫原的合成為獲得合格的生物素抗體，經(jīng)實驗合成了兩種不同的免疫原：

免疫原1：通過活化酯法將Biotin-NHS與BSA進行耦聯(lián)。Biotin-NHS首先溶解于N，N-二甲基甲酰胺溶劑中，質(zhì)量濃度為5 mg/mL；BSA溶解于0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中（CB，pH 9.6），質(zhì)量濃度為10 mg/mL。一定量的Biotin-NHS緩慢滴加至BSA溶液中，室溫下反應(yīng)2 h。反應(yīng)液中加入一定量2 mol/L的NH4Cl溶液（m（NH4Cl）∶m（Biotin-NHS）=2∶1），室溫反應(yīng)10 min。反應(yīng)液隨后使用磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）透析72 h。

因為抗體的親和力與特異性會受到載體蛋白與半抗原之間空間位置大小的影響［11-12］。因此在免疫原2的合成過程中引入了6-氨基己酸。

免疫原2：BSA溶解在去離子水中，質(zhì)量濃度為10 mg/mL，m（BSA）∶m（6-氨基己酸）∶m（EDC）=5∶10∶3），反應(yīng)液在室溫反應(yīng)4 h，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液透析72 h，獲得6-ACA-BSA。生物素耦聯(lián)過程與免疫原1中一致。

兩種免疫原的合成路徑見圖1。包被原的合成方法與免疫原1一致，將Biotin-NHS與OVA進行耦聯(lián)。

1.3.2免疫原與包被原的電泳表征合成的免疫原與包被原分別使用SDS-PAGE表征，實驗方案參照Laemmli方案［13］。系統(tǒng)分別使用質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠與8%的分離膠。樣品稀釋至質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL，分別與等體積的上樣緩沖液混合，100℃煮沸10 min，上樣時每孔10 μL，120 V電壓下90 min。體積分數(shù)10%的三氯乙酸固定后考馬斯亮藍染色生物電泳圖像分析系統(tǒng)中拍照保存。

1.3.3單克隆抗體的制備每一個免疫原分別免疫5只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫時20 μg免疫原溶解于100 μL生理鹽水，與弗氏完全佐劑等體積混合，乳化至形成油包水結(jié)構(gòu)后皮下多點注射免疫，每次免疫間隔3周，之后使用弗氏不完全佐劑。至間接ELISA法檢測獲得高效價與低半抑制濃度（IC50）小鼠血清。小鼠脾臟融合與細胞株篩選參照之前方案［14］。制備獲得細胞株的腹水，并采用辛酸飽和硫酸銨法純化得到單克隆抗體。

圖1　不同免疫原合成路徑Fig.1Synthesis of biotin immunogens

1.3.4Ic-ELISA的建立間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法的操作過程與傳統(tǒng)方法一致［15］。包被原由碳酸鹽緩沖溶液（pH 9.6）稀釋，100 μL/孔包被至96孔酶標板上。在實驗過程中分別優(yōu)化了以下因素：包被原種類（不同反應(yīng)的Biotin-NHS與OVA）；標準品稀釋液中氯化鈉含量［16］。在優(yōu)化后的最佳條件下，以生物素標準品濃度為橫坐標，對應(yīng)的OD450值作為縱坐標，建立標準抑制曲線，并確定檢測線性范圍與IC50值。

1.3.5Ic-ELISA檢測生物素的特異性常見的部分B族維生素以及維生素A，D，E分別作為標準品使用建立的間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法進行檢測。交叉率（CR）由以下公式計算得出：

CR（%）=（生物素IC50值/其余維生素IC50值）× 100［17］

1.3.6實際樣品的檢測與添加回收實驗鮮奶，純牛奶，嬰幼兒奶粉，全脂奶粉分別購買自天資乳業(yè)與超市。樣品中生物素含量依據(jù)國標使用微生物鑒定法確定：GB 5413.19-2010。

液態(tài)奶樣品4℃，5 000 g離心15 min后除去上層脂肪，下層樣品去離子水使用標準品稀釋液稀釋10倍后待測。奶粉樣品按料液質(zhì)量體積比1∶9比例溶于去離子水，60℃水浴30 min，4℃，5 000 g離心15 min后除去上層脂肪，下層樣品去離子水使用標準品稀釋液稀釋10倍后待測。

在樣品處理前，液態(tài)奶樣品中分別添加20，40，80 ng/mL生物素標準品，奶粉中分別添加200，400，800 ng/g生物素標準品，進行樣品添加回收實驗。每個樣品檢測重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1免疫原與包被原的合成

兩種免疫原分別應(yīng)用于小鼠免疫。免疫原1的合成中應(yīng)用4個不同的質(zhì)量比：1∶5，1∶10，1∶20，1∶40。免疫原2的合成中，BSA首先與6-ACA以1∶2的反應(yīng)比（w∶w）進行耦聯(lián)，透析后m（BSA）∶m（Biotin-NHS）分別以1∶5，1∶10，1∶20，1∶40反應(yīng)比耦聯(lián)生物素。包被原合成路線與免疫原1一致，反應(yīng)比m（OVA）∶m（Biotin-NHS）分別為1∶1，1∶2和1∶4。

2.2免疫原與包被原的表征

所合成的免疫原與包被原均由SDS-PAGE方法表征，表征結(jié)果如圖2。當?shù)鞍壮晒︸盥?lián)上生物素小分子后，蛋白條帶的位置在膠上會出現(xiàn)明顯的偏移，蛋白上耦聯(lián)的小分子越多，偏移越明顯。不同反應(yīng)比的免疫原與包被原在膠上可以明顯區(qū)分開。

圖2　不同免疫原與包被原電泳表征Fig.2SDS-page characterization of immunogens and coating antigen

2.3單克隆抗體的制備與表征

免疫小鼠三免后斷尾采血間接ELISA法檢測血清。不同免疫原免疫小鼠檢測結(jié)果比較，免疫原2免疫小鼠具有較低的IC50值，其中反應(yīng)比1∶10的免疫原效果最佳：反應(yīng)比1∶5免疫原免疫小鼠IC50過高，反應(yīng)比1∶20與1∶40免疫原免疫小鼠死亡率過高。同時具有高效價與較低IC50的小鼠被選擇進行脾臟融合實驗，得到細胞株3C2并選擇其建立間接競爭酶聯(lián)吸附測定方法。

2.4Ic-ELISA的建立與優(yōu)化

不同反應(yīng)比的包被原對抗體效價與IC50的影響十分明顯。在Ic-ELISA的優(yōu)化過程中使用了3個不同反應(yīng)比的包被原，每個包被原選用3個不同包被質(zhì)量濃度（0.3，0.1，0.03 μg/mL）檢測抗體效價（圖3）。依據(jù)抗體效價選擇合適工作點分別檢測生物素IC50值（表1）。

檢測結(jié)果顯示反應(yīng)比越高的包被原在相同的包被濃度下檢測的抗體效價越高。但當反應(yīng)比太高或者太低的時候，抗體的IC50值均不理想。只有當在合適的反應(yīng)比條件下合成的包被原既可以提供較高的抗體效價，又具有較低的抗體IC50值。結(jié)果表明，當反應(yīng)比m（OVA）∶m（Biotin）為1∶2時，合成的包被原效果最佳。最佳工作點條件為包被質(zhì)量濃度0.03 μg/mL，抗體質(zhì)量濃度為0.3 μg/mL。

圖3　不同包被原檢測抗體效價Fig.3Atibody titer detection for different kinds of coating antigens

表1　不同包被原檢測IC50值（n=7）Table 1IC50values for different kinds of coating antigen（n=7）

不同質(zhì)量分數(shù)（0%，0.4%，0.8%，1.6%，3.2%）氯化鈉的標準品稀釋液體系具有不同的離子強度?？贵w決定簇與抗原決定簇表面的離子鍵對抗原抗體反應(yīng)具有一定的抑制作用，從而會影響抗體的最大吸光值和IC50值。不同質(zhì)量分數(shù)氯化鈉含量的標準品稀釋液檢測結(jié)果如圖4。當氯化鈉質(zhì)量分數(shù)在1.6%以下時，最大的光密度值（A450nm）基本保持在一個穩(wěn)定的水平上，當氯化鈉質(zhì)量分數(shù)高于1.6%時，A450nm值出現(xiàn)較大的下降。這可能是由于當氯化鈉質(zhì)量分數(shù)上升時，抗體與包被原的吸附結(jié)合能力受到影響。當氯化鈉質(zhì)量分數(shù)為0.8%時，檢測得到的IC50值最低。

圖5中顯示綜合實驗結(jié)果，在最優(yōu)的Ic-ELISA條件下，生物素檢測標準曲線方程為Y=0.112+ 1.432/［1+（x/2.32.）1.834］，R2值為0.996，IC50值為2.01 ng/mL，最低檢測限為0.32 ng/mL（IC10）。

2.5特異性檢測

在最優(yōu)的Ic-ELISA條件下，乳制品中常見的部分維生素被用來進行抗體的特異性檢測，包括：維生素A，C，D，E，K1以及維生素B1（硫胺素），B2（核黃素），B3（煙酸），B5（泛酸），B6（吡多胺），B9（葉酸），B12（鈷胺素）。實驗結(jié)果表明建立的Ic-ELISA方法對生物素的檢測具有很好的特異性，對乳制品中其余常見維生素均沒有交叉。

圖4　標準品稀釋液中離子強度的影響（n=7）Fig.4Effects of ionic strength in assay butter on Ic-ELISA performance（n=7）

圖5　最優(yōu)條件下生物素抑制曲線（n=7）Fig.5Optimized inhibition standard curve for biotin analysis by Ic-ELISA（n=7）

2.6實際樣品檢測與添加回收

實驗中所使用鮮奶，純牛奶，嬰幼兒奶粉，全脂奶粉樣品樣品分別依據(jù)國標（GB 5413.19-2010）微生物鑒定法與所建立Ic-ELISA方法進行檢測，結(jié)果如表2所示。Ic-ELISA方法檢測生物素含量為國標法檢測含量的82%與91%之間。

表2　樣品檢測（n=3）Table 2Sample detection（n=3）

在液態(tài)奶與奶粉樣品中分別各自添加3個不同含量的生物素標準品，使用Ic-ELISA方法進行檢測。所有樣品中3個生物素添加量均可被檢測出，回收率在93%與120%之間。實驗結(jié)果顯示：利用獲得的高靈敏度抗體所建立的Ic-ELISA方法對液態(tài)奶與奶粉中的生物素含量檢測具有較好檢出結(jié)果。

3　結(jié)語

在作者的研究中，利用不同方案合成的生物素免疫原免疫小鼠，經(jīng)過檢測與細胞融合實驗獲得的對生物素具有高靈敏度與高特異性的單克隆抗體，并以此為基礎(chǔ)建立了Ic-ELISA方法，并對所建立的Ic-ELISA方法中的檢測條件進行了優(yōu)化。運用所建立生物素Ic-ELISA方法對鮮奶與奶粉等乳制品中的生物素含量進行了檢測，檢測結(jié)果顯示此方法對鮮奶與奶粉中的生物素質(zhì)量濃度具有良好的檢測效果，其檢出數(shù)值與國標檢出數(shù)值相比，符合率達到82%～91%，對添加樣品的檢測也具有很好的回收率，達到93%～120%。與國標相比，所建立的Ic-ELISA方法具有結(jié)果穩(wěn)定，操作方便和靈敏度高等優(yōu)點。

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An Indirect Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Method for the Detection of Biotin

GE Wenliang1，XU Chuanlai2
（1.Wuxi No.2 People's Hospital，Wuxi 214002，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Different kinds of biotin immunogens were synthesized for mice immunization and the obtained monoclone antibody was used for the development of indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.With the method of high specificity and sensitivity，the half inhibition concentration of biotin was 2.01 ng/mL and the detection limit was 0.32 ng/mL，and the biotin content in liquid milk and milk powder samples could be accurately detected.Compared with the national standard，the method was sufficiently stable，convenient，sensitive and accurate for the analysis of biotin in real samples.

dairy products，biotin，indirect competitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay（Ic-ELISA）

R 392.33

A

1673—1689（2015）10—1045—06

2014-12-11

國家“十二五”科技支撐計劃項目（2012BAD29B04）。

葛文亮（1965—），男，江蘇無錫人，主任技師，主要從事臨床醫(yī)學檢驗與免疫學研究。E-mail：2324999898@qq.com