李樹紅，蔣然然，楊　娟，劉　玲，鐘海霞，陳志光，李美良，李　冉

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安　625014）

鰱魚卵中兩種高分子半胱氨酸蛋白酶抑制因子的純化與鑒定

李樹紅，蔣然然，楊娟，劉玲，鐘海霞，陳志光，李美良，李冉

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安625014）

以鰱魚卵為材料，通過勻漿、酸處理和超濾制備半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cystine proteinase inhibitors，CPIs）粗提液，進而經(jīng)Sephacryl S-100分子篩層析、Blue Sepharose 6 Fast Flow染料親和層析、SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析、ConA Sepharose 4B親和層析，獲得兩種純化的高分子CPIs，即ConA不吸附部分a-1和吸附部分的糖蛋白a-2。二者分別被純化了102.62 倍和274.28 倍，酶活回收率分別為2.02%和1.42%。通過TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相色譜結(jié)合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳及其反相酶譜法分析，表明a-2及再次經(jīng)高效液相色譜法回收的a-1在電泳圖上均呈單一帶，a-2為單一峰，且a-1的分子質(zhì)量為139 ku，a-2的分子質(zhì)量為92 ku。二者均能抑制半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶和鰱魚組織蛋白酶L）但不抑制絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）。根據(jù)a-1和a-2的分子質(zhì)量及抑制活性特征和糖蛋白特性，推測二者可能為鰱魚卵Kininogens的不同形式。

鰱魚卵；半胱氨酸蛋白酶抑制因子；Kininogen；純化；鑒定

半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors，CPIs）是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白酶的抑制因子，廣泛分布于動植物組織、體液及分泌液中［1］。Cystatins超家族是動物源CPIs的最主要類群，其根據(jù)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)劃分為3 個家族即Stefin（家族Ⅰ，約11 ku），Cystatin（家族Ⅱ，約13 ku），以及Kininogen（家族Ⅲ，50～120 ku）［1-2］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，Cystatins超家族成員在骨生長調(diào)節(jié)［3］、感染與免疫［4-5］、抗菌［6］、精子成熟與胚胎發(fā)育［7］、細(xì)胞凋亡［8］、腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移抑制［9-10］等機體的多種生理和病理過程發(fā)揮重要作用。此外，在食品領(lǐng)域的相關(guān)研究表明，CPIs能抑制引起魚糜凝膠劣變的相關(guān)內(nèi)源性熱穩(wěn)定半胱氨酸蛋白酶，改善魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)［11-12］，因此還有望開發(fā)魚糜制品彈性改良劑。目前，對陸生哺乳動物來源CPIs的研究相對較深入。但對于進化地位和生存環(huán)境明顯不同的魚類，其CPIs在結(jié)構(gòu)、活性特征、生理功能等方面的研究尚存在較多空白。

我國鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）資源十分豐富，產(chǎn)量位居淡水養(yǎng)殖的第二位［13］，在其加工中會產(chǎn)生大量廢棄下腳料，有研究表明在魚類卵巢、魚皮、血漿、心臟、腸、腮等下腳料中均存在CPIs活性［14-18］。本課題組前期報道了鰱魚卵、皮等廢棄組織中幾種高低不同分子質(zhì)量CPIs的部分生化特性［19-21］和抑菌活性［22］，并且從鰱魚卵中部分純化了一種約89 ku的糖基化高分子質(zhì)量CPI［23］。而本實驗在前期工作基礎(chǔ)上，采用高效合理的蛋白層析分離方法，同時從鰱魚卵中獲得兩種高度純化的高分子質(zhì)量CPIs。通過凝膠過濾高效液相色譜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和反相酶譜法，鑒定了兩種高分子CPIs的純度和分子質(zhì)量。此外，測定了其抑制活性類型，并討論了其可能的糖側(cè)鏈結(jié)構(gòu)。本實驗結(jié)果為后續(xù)進一步充分研究鰱魚高分子CPIs的活性和功能提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

懷卵期（Ⅳ期）鰱魚于四川崇州通威養(yǎng)殖中心采集，宰殺后立即采卵，液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱凍藏，使用前4 ℃解凍。

熒光合成肽（Z-Phe-Arg-MCA）、偶氮酪蛋白（azocasein）、木瓜蛋白酶（papain）、胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）、熒光標(biāo)準(zhǔn)品7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、明膠、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、α-甲基-D-甘露糖苷美國Sigma公司；Sephacryl S-100、Blue Sepharose 6 Fast Flow、SP-Sepharose Fast Flow、Con A Sepharose 4B美國GE公司；寬分子質(zhì)量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（6.5～200 ku）日本TaKaRa公司；BCA蛋白檢測試劑盒江蘇碧云天生物技術(shù)研究院；鰱魚組織蛋白酶L由本實驗純化制備。

1.2儀器與設(shè)備

Biologic Duo Flow全自動中高壓層析系統(tǒng)、Mini Protein電泳槽及PowerPac 3000電泳電源 美國Bio-Rad公司；B4i-BR4i大容量高速離心機法國Jouan公司；TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相柱日本Tosoh公司；LC-2010C HT高效液相色譜儀日本Shimadzu公司；Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀美國Thermo公司；Ultra-8050/03超濾杯美國Millipore公司；V-1100D分光光度計上海美譜達(dá)公司。

1.3方法

1.3.1鰱魚卵中CPIs的粗提取

鰱魚卵（Ⅳ期）65 g于4 ℃解凍后，用4 倍體積的提取液（含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）勻漿，離心（10 000×g，20 min），取上清液60 ℃靜置1 h，用4 層紗布過濾，濾液經(jīng)1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0，靜置10 min后再用1 mol/L NaOH回調(diào)至pH 6.0。隨后離心（10 000×g，10 min）取上清，樣液經(jīng)Vivafl ow 200膜包（截留分子質(zhì)量為10 ku）超濾濃縮至適當(dāng)體積，得鰱魚卵CPIs粗提液。以上步驟除特殊說明外均在4 ℃條件下操作，以Azocasein為底物，測定每一步驟后的CPIs粗提液的總抑制活力和酶比活力。

1.3.2蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測定

采用Bradford［24］方法測定各步驟提取液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.3.3CPIs抑制活性的測定

參考Li等［18］所用Azocasein法。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中CPIs的加入量，使測得對木瓜蛋白酶的抑制率在30%～70%之間［25］。CPIs抑制活性單位定義為：在一定反應(yīng)條件下，440 nm波長處的吸光度降低0.01即為一個單位。利用Azocasein法監(jiān)測粗提及層析各步驟的總酶活力和酶比活力。

熒光合成肽（Z-Phe-Arg-MCA）法：層析過程中，以利用靈敏度更高的熒光合成肽Z-Phe-Arg-MCA為底物，于激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm條件下監(jiān)測洗脫物對木瓜蛋白酶活性的抑制情況，具體參照Anastasi等［26］方法。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系中CPIs的加入量，使測定的抑制率在30%～70%之間［25］。酶活力單位定義為：在反應(yīng)條件（40 ℃、pH 6.8）下，能夠在1 min內(nèi)水解底物并釋放出1 nmol AMC產(chǎn)物的酶活性量（1 nmol AMC/min），為一個酶活力單位。一個抑制活性單位定義為：抑制1 個單位的酶活力。

1.3.4鰱魚卵CPIs的層析純化

取上述卵的濃縮粗提液，4 ℃條件下進行層析純化，具體步驟如下：樣品經(jīng)微濾后上預(yù)先平衡的Sephacryl S-100分子篩柱（2.6 cm×90 cm）層析。用含0.2 mol/L NaCl的20mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集1.0 mL。收集高分子質(zhì)量部分的活性洗脫物。經(jīng)A液（50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）透析后上已平衡的Blue Sepharose 6 Fast Flow染料親和柱（1.5 cm×9 cm）層析。上樣后用含0～1 mol/L NaCl的A液進行梯度洗脫，流速2.0 mL/min，每管收集2 mL。收集目的蛋白。用B液（20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6.5）透析后進行SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換柱（1.0 cm×6 cm）層析。上樣后用含0～1 mol/L NaCl的B液進行梯度洗脫，流速0.90 mL/min，每管收集0.45 mL。將陽離子層析收集到的活性部分透析（C液：含0.2 mol/L NaCl、1 mmol/L CaC12、l mmol/L MnCl2的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0）后，上預(yù)先平衡的ConA Sepharose 4B親和柱（0.5 cm×5 cm）層析。上樣后用含1 mol/L的α-甲基甘露糖苷的A液洗脫，流速0.1 mL/min，每管收集0.2 mL。所得的活性部分，濃縮作為最終純化物。

1.3.5TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相色譜分析

TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相柱（7.8 mm×30 cm）預(yù)先用D液 （含0.1 mol/L Na2SO4和0.05 g/100 mL NaN3的0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 6.7）平衡。收集ConA Sepharose 4B親和層析所得活性部分b-1和b-2，經(jīng)透析（截留分子質(zhì)量14 ku的透析袋）、濃縮（截留分子質(zhì)量30 ku的超濾膜）、微濾（0.22 μm的微濾膜）后上TSK G2000 SWXL分析。用D液以0.5 mL/min的流速進行洗脫，并回收目的蛋白。

1.3.6鰱魚卵高分子CPIs的SDS-PAGE鑒定

參考Laemmli［27］的方法。采用4%濃縮膠和12%分離膠。每泳道上樣20 μL?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液（V（95%乙醇）∶V（冰醋酸）∶V（蒸餾水）= 4.5∶0.5∶5）脫色至電泳條帶清晰可見。

1.3.7鰱魚卵高分子CPIs的反相酶譜分析

反相酶譜SDS電泳基本參照Li等［18］的方法。上樣前樣品不煮沸。電泳結(jié)束后用含體積分?jǐn)?shù)2.5%的Triton X-100復(fù)性，超純水漂洗數(shù)次，膠放入含0.4 mg/mL木瓜蛋白酶的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中4 ℃反應(yīng)1 h，隨后置于含1%明膠的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中37 ℃反應(yīng)12 h，染色脫色同SDS-PAGE分析。

1.3.8鰱魚卵高分子CPI的抑制活性類型鑒定

為鑒定抑制類型，參考Anastasi［26］、Barrett［28］、Schwert［29］、Hummel［30］等的方法，分別以Z-Phe-Arg-MCA、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzoyl-L-arginine ethyl ether，BAEE）和N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯（N-benzoyl-L-tyrosine ethyl ether，BTEE）為底物，作高分子CPIs對半胱氨酸蛋白酶（木瓜蛋白酶和鰱魚組織蛋白酶L）以及絲氨酸蛋白酶（胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）的抑制曲線，縱坐標(biāo)以殘余酶活力表示。

2　結(jié)果與分析

2.1鰱魚卵高分子CPIs層析純化

鰱魚卵勻漿液經(jīng)酸處理、超濾、濃縮三步驟，共制得總活力為20 446.75 U的CPIs粗提液，并用于后續(xù)的層析純化。由圖1可知，粗提濃縮液經(jīng)Sephacryl S-100分子篩層析后得到分子質(zhì)量高低不同的兩個活性部分，即活性峰Ⅰ和活性峰Ⅱ，雖然低分子質(zhì)量峰Ⅱ的活性量稍低于峰Ⅰ部分，但由于其蛋白吸附峰值低，酶比活力則更高，因此當(dāng)只取其中高分子質(zhì)量活性峰Ⅰ用于下步層析時，酶活回收率從51.16%銳減至22.53%，酶比活力也略有降低（表1）。進一步對活性峰Ⅰ部分進行Blue Sepharose 6 Fast Flow染料親和層析（圖2），當(dāng)鹽濃度升至1 mol/L時可將目的蛋白峰特異地洗脫下來。該步驟有效去除了雜蛋白，純化倍數(shù)顯著提高到11.92 倍（表1）。收集染料親和層析吸附部分的活性部分Ⅰ-2，經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析（圖3）將目的蛋白進一步純化，將得到的活性峰Ⅰ-2-a部分，透析濃縮后上ConA Sepharose 4B親和層析，在不吸附部分得到活性峰a-1，而吸附部分得到糖基化活性蛋白峰a-2（圖4）。經(jīng)粗提、分子篩、染料親和、陽離子、ConA親和層析后，鰱魚卵CPI a-1和a-2分別純化了約102.62 倍和274.28倍，酶活回收率分別為2.02%和1.42%（表1）。

圖1　鰱魚卵CPIs的Sephacryl S-100分子篩層析Fig.1　Sieve chromatography of CPIs from silver carp egg on Sephacryl S-100

圖2　鰱魚卵高分子CPIs的Blue Sepharose 6 Fast Flow染料親和層析Fig.2　Dye affinity chromatography of high-molecular-weight CPIs from silver carp egg on Blue Sepharose 6 Fast Flow column

圖3　鰱魚卵高分子CPIs的SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析Fig.3　Cation exchange chromatography of high-molecular-weight CPIs from silver carp eggs on SP-Sepharose Fast Flow column

圖4　鰱魚卵高分子CPIs的ConA Sepharose 4B親和層析Fig.4　Affinity chromatography of high-molecular-weight CPIs fromsilver carp eggs on ConA Sepharose 4B column

表1　鰱魚卵高分子CPIs組分a-1和a-2純化結(jié)果Table 1 Purification of a-1 and a-2 from silver carp eggs

2.2鰱魚卵CPIs的TSK G2000 SWXL凝膠過濾高效液相色譜分析

圖5　TSK-GEL G2000 SW凝膠過濾高效液相色譜分析CPIs組分a-1Fig.5　Analysis of a-1 by HPLC on TSK-GEL G2000 SW

圖6　TSK-GEL G2000 SW凝膠過濾高效液相色譜分析CPIs組分a-2Fig.6　Analysis of a-2 by HPLC on TSK-GEL G2000 SW

ConA Sepharose 4B親和層析收集的活性峰a-1和a-2，分別上TSK G2000 SWXL（圖5和圖6），由圖可知，盡管a-1主要在12.20 min出現(xiàn)目的峰，但是仍存在少量雜蛋白峰。因此進一步回收12.20 min的目的峰，冷干復(fù)溶后進行電泳分析?；钚苑錫-2部分上TSK G2000 SWXL后，僅在14.62 min呈現(xiàn)了單一峰，峰面積達(dá)到94.7%。

2.3鰱魚卵CPIs的SDS-PAGE及反相酶譜分析

圖7　鰱魚卵高分子CPIs的SDS-PAGE及反相酶譜分析Fig.7　SDS-PAGE and reversed-phase enzyme zymogram of CPIs from silver carp eggs

由圖7可知，分子篩層析收集的高分子部分（圖7A中泳道1），主要在29 ku以上呈現(xiàn)蛋白條帶，說明分子篩層析能去除粗提液中存在的＜20 ku的低分子質(zhì)量CPIs，有利于正確計算后續(xù)純化過程高分子質(zhì)量CPIs比活性變化及純化倍數(shù)。而經(jīng)過Blue染料親和層析后（圖7A中泳道2），可能是層析過程中發(fā)生了非限制性水解導(dǎo)致在29 ku以下及50 ku附近出現(xiàn)了蛋白條帶，盡管如此，該步驟非常有效地去除了116～97 ku及66 ku附近的部分雜蛋白，與層析圖結(jié)果一致，即目的蛋白高度富集，比活性和純化倍數(shù)明顯升高。繼而在陽離子交換和ConA親和層析的逐步純化后，a-1部分的高分子質(zhì)量CPI純度顯著提高，但是尚存在少量雜蛋白（圖7A中泳道4）。而a-2部分的高分子質(zhì)量CPI則得到充分純化，呈現(xiàn)單一條帶（圖7C中泳道7），這分別與a-1和a-2的TSK-GEL G2000SW凝膠過濾高效液相色譜分析結(jié)果一致（圖5和圖6）。TSK-GEL G2000SW上回收的a-1（圖7B中泳道5）及ConA親和層析得到的a-2經(jīng)反相酶譜鑒定，均為高分子質(zhì)量CPI（圖7B中泳道6，圖7C中泳道8），分子質(zhì)量分別約為139 ku和92 ku。

2.4鰱魚卵高分子CPIs抑制活性類型的鑒定

圖8　鰱魚卵高分子CPIs組分a-1對幾種蛋白酶的抑制曲線Fig.8　Inhibitory curves of a-1 to some proteinases

a-1對所選半胱氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的抑制曲線結(jié)果見圖8。隨著a-1加量逐漸增加，木瓜蛋白酶、組織蛋白酶L殘余酶活力逐漸下降，但是胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活力基本保持不變，說明a-1對木瓜蛋白酶、組織蛋白酶L均具有明顯的抑制活性；而對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不具有抑制活性。a-2的結(jié)果與此相同（抑制曲線圖省略）。因此，a-1和a-2均屬于半胱氨酸蛋白酶抑制因子。

3　討 論

已知動物源CPIs的Cystatins超家族中，Kininogen（家族Ⅲ）是一種單鏈糖蛋白，由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈兩部分之間為血管舒緩激肽（bradykinin），其分子質(zhì)量約50～120 ku，是超家族中分子質(zhì)量最高的抑制劑［1-2］。

目前對魚類高分子Kininogen進行明確鑒定的相關(guān)報道較少。僅Ylonen等［31］從大西洋鮭魚Atlantic salmon（Salmo salar L.）魚皮中純化出表觀分子質(zhì)量為76 ku的高分子糖基化CPIs，從花狼鳚Spotted wolffish（Anarhichas minor）和大西洋鱈魚Atlantic cod（Gadus morhua L.）中純化出表觀分子質(zhì)量分別為67 ku和78 ku的CPIs［16］，由于含有魚類血管舒緩激肽序列RRPPGWSPLR，且有效抑制半胱氨酸蛋白酶，但對絲氨酸蛋白酶無抑制作用，因此被明確鑒定為魚類Kininogens。其他多數(shù)研究則根據(jù)純化的高分子CPIs的分子質(zhì)量、抑制活性類型和糖蛋白本質(zhì)，推測為魚類Kininogen。如大麻哈魚Chum salmon（Oncorhynchus keta）血漿中70 ku［18，32］和卵中72.6 ku［33］的高分子質(zhì)量CPIs以及Ustadi等［34］從阿拉斯加鱈魚Alaska pollock（Theragra chalcogramma）卵、玻璃魚Glassfish（Lipari tanakai）卵、胡瓜魚Pond smelt（Osmerus mordax）卵、大麻哈魚Chum salmon（Oncorhynchus keta）卵、太平洋鯡魚Pacifi c herring（Clupea pallasi）卵中分別純化的分子質(zhì)量為66.7、67、84.4、89、120 ku的高分子CPIs，均被推測為Kininogen。

本實驗經(jīng)過粗提取和多步層析后，最終在ConA親和層析的不吸附和吸附部分，分別得到高度純化的鰱魚卵高分子CPIs，即139 ku的a-1和92 ku的a-2。根據(jù)分子質(zhì)量及抑制活性特征，初步推測二者可能為鰱魚卵Kininogens的不同形式。親和填料配基ConA，主要吸附含有甘露糖苷或葡萄糖苷的糖蛋白，因此可以確定純化的a-2為糖蛋白，其可能與團隊前期報道的部分純化的約89 ku［23］的糖蛋白CPI-1相似。盡管a-1沒有與ConA結(jié)合，但尚不能因此判斷a-1為非糖基化蛋白。糖基化是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾，一些聚糖結(jié)構(gòu)決定的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。糖蛋白中，糖的組成成分比較復(fù)雜，含多種類型的糖類。根據(jù)報道，魚類Kininogen的糖基化結(jié)構(gòu)中即包括N-聚糖也包括O-聚糖［31］。盡管N-聚糖的五糖核心中包括甘露糖苷或葡萄糖苷鍵，但除高甘露糖型的簡單性糖鏈外，N-聚糖還包括復(fù)雜型、混合型，而O-聚糖的4 種類型中與糖基化位點上羥基氨基酸的羥基O原子共價結(jié)合的糖類，均非甘露糖和葡萄糖。 因此，可能由于ConA與某些N-聚糖，尤其是O-聚糖的結(jié)合可能不夠緊密，導(dǎo)致a-1在不吸附部分洗脫下來，此外層析過程中糖側(cè)鏈的丟失也可能是原因之一。因此，a-1是否為糖蛋白，a-1、a-2的糖基化位點和糖苷鍵類型，還有待進一步深入研究。

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Purification and Characterization of Two High-Molecular-Weight Cystine Proteinase Inhibitors （CPIs）from Silver Carp Eggs

LI Shuhong， JIANG Ranran， YANG Juan， LIU Ling， ZHONG Haixia， CHEN Zhiguang， LI Meiliang， LI Ran
（College of Food Science， Sichuan Agricultural University， Ya'an625014， China）

In this study， crude extract rich in cystine proteinase inhibitors （CPIs） from silver carp eggs was prepared by homogenization， acidification and ultrafiltration. After purification by an array of chromatography on Sephacryl S-100，SP-Sepharose Fast Flow， Blue Sepharose 6 Fast Flow and ConA Sepharose 4B， two high-molecular-weight （HMW） CPIs， a-2 and a-1 with or without absorption on ConA， were obtained. They were purified by 102.62 and 274.28 folds， with recoveries of 2.02% and 1.42% respectively. Through analysis by TSK G2000 SWXL gel filtration HPLC and identification by SDS-PAGE and reverse zymography， both part of a-1 recovered by HPLC and a-2 showed a single band on electrophoresis with molecular weight of 139 and 92 ku， respectively. Both of them could inhibit cysteine protease （papain and silver carp cathepsin L） but not serine protease （trypsin and chymotrypsin）. From the characteristics， inhibitory activity and glycoprotein features， a-1 and a-2 may be the different forms of kininogens in silver carp eggs.

silver carp egg； cysteine protease inhibitors； kininogen； purification； identification

TS254.1

A

1002-6630（2015）23-0006-06

10.7506/spkx1002-6630-201523002

2015-01-06

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31101249）；四川省教育廳自然科學(xué)重點基金項目（10ZA052）

李樹紅（1975—），女，副教授，博士后，研究方向為水產(chǎn)品加工理論與技術(shù)。E-mail：xiaoshu928@126.com