蔡　俊，游智能

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢　430068）

發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素的研究進(jìn)展

蔡俊，游智能

（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢430068）

蝦青素（astaxanthin）是一種類胡蘿卜素，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，抗癌功能，顯著的著色能力以及增強(qiáng)免疫力等功能。本文介紹了蝦青素的生物活性及其在食品、化妝品、保健品、水產(chǎn)養(yǎng)殖和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，并著重對(duì)蝦青素的發(fā)酵法生產(chǎn)研究現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述，提出了蝦青素未來(lái)的主要研究方向，以期為蝦青素的研究開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

蝦青素；生物活性；發(fā)酵

蝦青素（astaxanthin）是一種類胡蘿卜素，分子式C40H52O4，摩爾質(zhì)量596.86 g/mol，全稱3，3'-二羥基-β，β'-胡蘿卜素-4，4'-二酮（圖1a），有（3R， 3'R）、（3R，3'S）、（3S， 3'S）3 種旋光異構(gòu)體（圖1b～1d），化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。Andrewes等［1-2］研究發(fā)現(xiàn)紅球藻和磷蝦卵中蝦青素的構(gòu)象為（3S， 3'S），1975年又分析了紅法夫酵母中蝦青素的構(gòu)象，發(fā)現(xiàn)92%的異構(gòu)體是（3R， 3'R）。蝦青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，抗癌功能，顯著的著色能力以及增強(qiáng)免疫力等功能，在水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、化妝品、醫(yī)藥和保健品等領(lǐng)域均被利用［3-10］。

圖1　蝦青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式（a）和3 種旋光異構(gòu)體（b～d）　［11--22］Fig.1　Chemical structure （a） and three stereoisomers （b-d） of astaxanthin［1-2］

目前，蝦青素的生產(chǎn)主要有3 種方法：化學(xué)合成法、提取法和微生物發(fā)酵法（表1）?；瘜W(xué)合成法具有生產(chǎn)成本較低，產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，但是合成的蝦青素多為順式結(jié)構(gòu)，而動(dòng)物機(jī)體只對(duì)反式蝦青素有較高的吸收利用率；提取法主要從水產(chǎn)品加工的廢棄物中提取蝦青素，提取前必須除去廢棄物中的石灰質(zhì)成分，提取費(fèi)用高且容易污染；微生物發(fā)酵法主要有兩種方式：一是利用藻類生產(chǎn)；二是利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵法生產(chǎn)的蝦青素天然無(wú)污染，但受到成本高、培養(yǎng)條件苛刻、產(chǎn)量低等因素的制約［11-12］。筆者參考近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)對(duì)蝦青素的生物活性及應(yīng)用進(jìn)行了概述，并著重綜述了蝦青素的發(fā)酵法生產(chǎn)研究現(xiàn)狀，提出了蝦青素未來(lái)的主要研究方向，以期為蝦青素的研究開(kāi)發(fā)和綜合利用提供理論依據(jù)。

表1　蝦青素的生產(chǎn)方法Table 1 Comparison of production methods for astaxanthin

1　蝦青素的生物活性及應(yīng)用現(xiàn)狀

蝦青素具有抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫力、預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病、提高動(dòng)物繁殖能力和存活率、著色等功能，已被廣泛接受和應(yīng)用。

1.1蝦青素的生物活性

1.1.1抗氧化

蝦青素是一種非VA原的類胡蘿卜素，其獨(dú)特共軛雙烯以及不飽和羰基的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它超強(qiáng)的抗氧化活性，其淬滅活性氧和捕捉自由基的能力是其他類胡蘿卜素的10 倍以上，是VE的80～550 倍［23］，所以有“超級(jí)VE”之稱。Kiyotaka等［24］通過(guò)隨機(jī)、雙盲人體實(shí)驗(yàn)證明了蝦青素有助于改善紅細(xì)胞抗氧化性能，降低磷脂氫過(guò)氧化物水平；Lee等［25］比較了番茄紅素、玉米黃素、葉黃素、異玉米黃素和蝦青素5 種類胡蘿卜素在豆油光氧化作用中活性氧能力，發(fā)現(xiàn)蝦青素淬滅活性氧能力最強(qiáng)。

1.1.2抗癌

研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素具有比β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素更強(qiáng)的抑制癌變的能力。Kim等［26］通過(guò)對(duì)被注入易引起胃潰瘍性病變的萘普生小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼喂蝦青素，小鼠體內(nèi)的胃潰瘍不斷減少甚至消失，防止了胃癌的發(fā)生。另外許多相關(guān)研究表明蝦青素對(duì)由黃曲霉毒素誘發(fā)的肝癌、口腔癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、皮膚癌和乳腺癌等癌癥都有著一定的預(yù)防和治療作用［27-31］。

1.1.3增強(qiáng)免疫力

蝦青素具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞分裂活性，在機(jī)體內(nèi)能起免疫調(diào)節(jié)作用［32］。Park等［33］研究發(fā)現(xiàn)蝦青素能增強(qiáng)貓?bào)w內(nèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒活性能力，并可以提高血漿免疫球蛋白和抗體的濃度。Boon等［34］研究表明蝦青素能增強(qiáng)狗機(jī)體的免疫力。

1.1.4預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病

蝦青素可以有效治療脊髓損傷、Parkinson綜合征、Alzheimer綜合征等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?5-36］。研究發(fā)現(xiàn)蝦青素能明顯降低血液中低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterin，LDL-C）的水平，防止心血管疾病的發(fā)生，而其他類胡蘿卜素如β-胡蘿卜素對(duì)LDL-C沒(méi)有明顯的影響［37］。

1.1.5提高動(dòng)物繁殖能力和存活率

蝦青素在動(dòng)物生殖過(guò)程中的作用類似于激素［38］，蝦青素可作為受精卵激素改善卵質(zhì)，保護(hù)受精卵抵御惡劣的環(huán)境，促進(jìn)卵的成熟，減少胚胎死亡，提高生殖能力。Torrissen等［39］發(fā)現(xiàn)成年鮭、鱒魚(yú)類在某些特定水域中不能繁衍后代，原因是它們產(chǎn)的卵子中和魚(yú)苗體內(nèi)缺乏蝦青素，所以蝦青素及其他類胡蘿卜素可能是通過(guò)提高動(dòng)物免疫力來(lái)提高存活率的。

1.1.6著色

蝦青素是一種脂溶性色素，能夠不經(jīng)修飾、轉(zhuǎn)換直接存儲(chǔ)在組織中［40］，所以能使一些鳥(niǎo)類的羽毛及水生動(dòng)物肌肉皮膚呈紅色或金色。Johnson等［41］在鮭魚(yú)等飼料中加入破碎的紅法夫酵母，發(fā)現(xiàn)魚(yú)體皮膚和肌肉中都積累了大量的蝦青素，顏色亮麗，味道鮮美。蝦青素作為一種著色劑加到畜、禽飼料中，可使禽蛋的蛋黃顏色加深，更有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，增強(qiáng)著色的效果，從而提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

1.2蝦青素的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前蝦青素主要作為一種功能性色素廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品、化妝品等領(lǐng)域，主要用作魚(yú)類、蝦蟹等甲殼類動(dòng)物以及家禽的飼料添加劑，提高畜禽、魚(yú)類的繁殖能力和成活率，改善健康狀況，優(yōu)化體色肉質(zhì)。天然蝦青素已被作為食品添加劑用于食品的著色、保鮮及增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)。Bjerkeng等［42］研究表明蝦青素有助于鱒魚(yú)片的保鮮。近年隨著蝦青素生物功能研究和藥理藥效實(shí)驗(yàn)的不斷深入，蝦青素因其在心血管疾病、癌癥、代謝綜合征、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、眼科疾病、皮膚病等疾病的預(yù)防和治療中具有突出的效果而受到了科學(xué)界極大的關(guān)注，表明蝦青素在醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域中具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值和廣闊開(kāi)發(fā)前景［43-45］。

2　發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素的研究進(jìn)展

當(dāng)前利用發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素主要有兩種方式：一是利用藻類生產(chǎn)；二是利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素。

2.1利用藻類生產(chǎn)蝦青素

自然界中一些藻類如衣藻（Chlamydomonas）、傘藻（Acetabularia）、裸藻（Euglena）中含有蝦青素。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是天然蝦青素含量最高的生物，達(dá)10～40 mg/g，因而是目前生產(chǎn)蝦青素的主要藻類。在脅迫條件下，雨生紅球藻能誘導(dǎo)積累蝦青素，積累量可達(dá)藻細(xì)胞干質(zhì)量的1.0%～5.0%，且所含蝦青素的結(jié)構(gòu)多為反式結(jié)構(gòu)，被公認(rèn)為天然蝦青素的最佳生物來(lái)源［46-47］。

2.1.1雨生紅球藻的生物特性［48-49］

雨生紅球藻是一種淡水單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門(mén)，團(tuán)藻目，紅球藻科，紅球藻屬，能夠進(jìn)行光合自養(yǎng)和化能異養(yǎng)，且兩種營(yíng) 養(yǎng)方式可同時(shí)進(jìn)行，藻細(xì)胞在適宜的生長(zhǎng)條件下為運(yùn)動(dòng)細(xì)胞，在脅迫條件下，如受到強(qiáng)光照射，缺氮、磷等因素的刺激，由運(yùn)動(dòng)細(xì)胞變?yōu)椴粍?dòng)細(xì)胞，此時(shí)開(kāi)始大量積累蝦青素。蝦青素在葉綠體內(nèi)合成，然后轉(zhuǎn)運(yùn)、貯存到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的脂質(zhì)液泡中。

2.1.2雨生紅球藻培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)蝦青素的研究現(xiàn)狀

雨生紅球藻培養(yǎng)技術(shù)的研究從20世紀(jì)90年代初就開(kāi)始了，國(guó)外研究比較多，國(guó)內(nèi)相對(duì)較少。目前雨生紅球藻培養(yǎng)技術(shù)的研究主要集中在兩個(gè)方面：一是提高生物量，包括培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法的優(yōu)化和確定最佳的培養(yǎng)條件等基礎(chǔ)性研究；二是誘導(dǎo)蝦青素的合成，即在較高生物量的基礎(chǔ)上，改善營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境條件，誘導(dǎo)細(xì)胞大量合成蝦青素［50］。雨生紅球藻的培養(yǎng)方法主要包括分批培養(yǎng)、補(bǔ)料培養(yǎng)、兩步培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)，在實(shí)際的操作過(guò)程中有時(shí)混合使用各種培養(yǎng)方法以提高蝦青素產(chǎn)量［51］。

2.1.3雨生紅球藻培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)蝦青素的展望

侯冬梅［52］對(duì)雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素的光誘導(dǎo)工藝的基本條件及營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)誘導(dǎo)積累蝦青素的效果進(jìn)行了研究和戶外驗(yàn)證，初步確定了戶外雨生紅球藻光誘導(dǎo)的基本工藝，并發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻固定化吸附誘導(dǎo)需水量少，難受到原生動(dòng)物的污染，具有成本低、節(jié)省水資源、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。

盡管利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外蝦青素研究的熱點(diǎn)，但依然有許多不足。雨生紅球藻中蝦青素的合成、積累和藻的生長(zhǎng)呈相反的趨勢(shì)：即當(dāng)藻細(xì)胞生長(zhǎng)條件適宜時(shí)，蝦青素的合成速率卻較低；當(dāng)蝦青素快速積累時(shí)，環(huán)境條件卻不利于藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致誘導(dǎo)蝦青素積累的逆境脅迫與藻細(xì)胞生物量的增加互成矛盾。而且雨生紅球藻培養(yǎng)周期長(zhǎng)，需要光照，生產(chǎn)場(chǎng)所受到限制，藻類破壁釋放蝦青素產(chǎn)率低，雨生紅球藻誘導(dǎo)積累蝦青素的具體機(jī)制又尚不清楚，從而限制了大規(guī)?；囵B(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素［50-52］。

總之，雨生紅球藻的培養(yǎng)技術(shù)雖已經(jīng)應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)，但技術(shù)還不成熟，仍需要深入細(xì)致的研究，可以通過(guò)探索雨生紅球藻誘導(dǎo)積累蝦青素的具體機(jī)制，從代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)的角度進(jìn)行發(fā)酵菌種育種和發(fā)酵優(yōu)化，也可以通過(guò)篩選或基因工程技術(shù)構(gòu)建出生長(zhǎng)周期短且薄壁的雨生紅球藻細(xì)胞來(lái)提高蝦青素的產(chǎn)量。

2.2利用酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素

自然界中含有蝦青素的酵母主要有紅法夫酵母（Phaffia rhodozyma/Xanthophyllomyces dendrorhous）、深紅酵母（Rhodotorula rubra）和粘紅酵母（Rhodotrula glutinis）等。紅法夫酵母中蝦青素含量最多，野生株系中蝦青素達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的0.05%，一些突變株系中達(dá)0.3%。紅法夫酵母是真菌界、真菌門(mén)、半知菌亞門(mén)、隱球酵母科、紅法夫酵母屬的唯一種，繁殖方式為無(wú)性繁殖中的芽殖，于1970年在美國(guó)的阿拉斯加的高山和日本北海道一帶山區(qū)落葉松的滲出液中分離得到，可利用有氧呼吸和發(fā)酵兩種方式代謝，是目前國(guó)內(nèi)外微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素普遍采用的真菌［53-55］。

紅法夫酵母可利用多種糖作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素，細(xì)胞代謝繁殖快，可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)；生產(chǎn)周期短，成本低，天然無(wú)污染；細(xì)胞壁容易破碎，生產(chǎn)的蝦青素為反式結(jié)構(gòu)，破壁后可直接作為飼料添加劑；被認(rèn)為是除雨生紅球藻外最為適合生產(chǎn)蝦青素的微生物。然而紅法夫酵母的蝦青素含量遠(yuǎn)不如雨生紅球藻，易受溫度、溶氧、碳氮源、pH值等發(fā)酵條件的影響。且紅法夫酵母中蝦青素的積累與酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)速率也是一對(duì)矛盾，往往在改變發(fā)酵條件增加蝦青素的合成、積累量時(shí)，菌體量卻相應(yīng)降低。因此，未來(lái)的研究可以通過(guò)探究細(xì)胞生理功能，選育蝦青素高產(chǎn)菌株，開(kāi)發(fā)廉價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化發(fā)酵工藝來(lái)實(shí)現(xiàn)紅法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素。目前國(guó)內(nèi)外許多研究主要集中在蝦青素的生物合成途徑、高產(chǎn)菌株的選育、發(fā)酵過(guò)程的控制與優(yōu)化以及蝦青素的提取與檢測(cè)等方面。

2.2.1蝦青素的生物合成途徑

紅法夫酵母生物合成蝦青素的途徑分為兩個(gè)階段：第一階段為β-胡蘿卜素的合成；第二階段為β-胡蘿卜素通過(guò)氧化 及羥基化生成蝦青素［56-57］。比較系統(tǒng)全面的蝦青素生物合成途徑如圖2所示。

異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（isop entenyl pyrophosphate isomerase）由idi基因編碼，催化烯焦磷酸（IPP）異構(gòu)化為二甲基烯丙基焦磷酸酯（DMAPP）［59］。從類異戊二烯前體物質(zhì)到β-胡蘿卜素的過(guò)程需要4 種酶：1）四異戊二烯焦磷酸（GGPP合成酶，由crtE基因編碼，能催化3 分子IPP與DMAPP縮合成前體物質(zhì)C20GGPP［60］；2）八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase），由crtYB基因編碼，催化兩分子GGPP縮合形成番茄紅素（lycopene）［61］；3）八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase），由crtI基因編碼，主要催化八氫番茄紅素通過(guò)一系列脫氫反應(yīng)生成為番茄紅素［62］；4）番茄紅素環(huán)化酶（lycopene cyclase），由crtYB基因編碼，催化番茄紅素分子兩端發(fā)生兩次環(huán)化，依次生成γ-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素［61］。最后β-胡蘿卜素經(jīng)過(guò)兩步酶促反應(yīng)最終生成蝦青素，其中酮化酶（ketolase）催化β-胡蘿卜素分子上引入2 個(gè)4位的酮基，羥化酶（hydroxylase）催化引入2 個(gè)3位的羥基。在紅法夫酵母細(xì)胞中，這兩步反應(yīng)則通過(guò)由crtS基因編碼的蝦青素合成酶來(lái)實(shí)現(xiàn)，它先對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行4位的酮化，然后進(jìn)行3位的羥化［63］。此外，.lvarez等［64］發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素P450還原酶（由crtR基因編碼）對(duì)紅法夫酵母中的crtS基因起輔助作用，可為底物的氧化提供電子。Ukibe等［65］表明在產(chǎn)β-胡蘿卜素的釀酒酵母中單獨(dú)表達(dá)crtR基因并沒(méi)有蝦青素生成，而crtS和crtR基因協(xié)同表達(dá)時(shí)，則有少量的蝦青素累積。紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑中部分相關(guān)酶及其基因如表2所示。

圖2　紅法夫酵母中蝦青素的生物合成途徑［22，5588］Fig.2　Biosynthetic pathway leading to astaxanthin formation in Phaffi a rhodozyma［2，58］

表2　紅法夫酵母蝦青素生物合成途徑中部分相關(guān)酶及其基因Table 2 Enzymes and their encoding genes related to the biosynthetic pathway of astaxanthin in Phaffifi a rhodozyma

2.2.2蝦青素高產(chǎn)菌株的選育

紅法夫酵母野生菌株產(chǎn)蝦青素僅350 .g/g左右，發(fā)酵溫度低，一般為18～22 ℃，易于退化，而且當(dāng)葡萄糖的質(zhì)量濃度超過(guò)2 g/100 mL時(shí)，蝦青素產(chǎn)量會(huì)急劇的下降，這些性質(zhì)使其工業(yè)化生產(chǎn)受到制約［68］。因此需要通過(guò)選育獲得高產(chǎn)蝦青素、耐高溫、發(fā)酵溫度高、不易退化的優(yōu)良菌種，再通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化可使蝦青素的產(chǎn)量達(dá)到最大。紅法夫酵母高產(chǎn)菌株的選育主要有誘變育種、原生體融合和基因工程育種3 種方式。

徐彩榮［57］采用超聲波、超聲波-氯化鋰及亞硝基胍對(duì)紅發(fā)夫酵母進(jìn)行誘變處理，用二苯胺及2-D-脫氧葡萄糖篩選蝦青素高產(chǎn)菌株進(jìn)行，最終得到一株蝦青素含量高，遺傳性能穩(wěn)定的突變菌株N-22，其蝦青素含量為949.19 μg/g，比出發(fā)菌株提高了4.37 倍。Sun等［69］用小于10 kGy的γ射線重復(fù)誘變，選育得到一株蝦青素高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量為3.3 mg/g，較野生菌株提高了50%。韓偉［51］經(jīng)過(guò)多次紫外誘變、微波誘變處理，二苯胺推理篩選，最終獲得一株遺傳穩(wěn)定性良好，蝦青素產(chǎn)量高的突變菌株TY-I-8，其蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了12.92 mg/L。Schmidt等［20］利用原生質(zhì)體融合技術(shù)，將親本細(xì)胞F406和F307原生質(zhì)體融合得到了一株蝦青素高產(chǎn)菌株。Verdoes等［61］首次研究了紅法夫酵母番茄紅素脫氫酶基因，并將idi基因成功導(dǎo)入大腸桿菌中，得到蝦青素高產(chǎn)菌株，為紅法夫酵母蝦青素合成的基因工程育種研究奠定了基礎(chǔ)。目前，誘變育種仍然是對(duì)高產(chǎn)菌株進(jìn)行選育的主要途徑。因此，應(yīng)該尋找新型的誘變育種技術(shù)運(yùn)用到紅法夫酵母的菌種改良中，以提高蝦青素的產(chǎn)量。

2.2.3發(fā)酵過(guò)程的控制與優(yōu)化

發(fā)酵過(guò)程的控制與優(yōu)化主要集中于培養(yǎng)基和發(fā)酵條件、前體物質(zhì)和增強(qiáng)劑、發(fā)酵方法等因素對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響。獲得蝦青素高產(chǎn)菌株后，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，可進(jìn)一步提高蝦青素的產(chǎn)量，同時(shí)研制廉價(jià)的培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵工藝來(lái)降低成本，為紅法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素提供理論依據(jù)。

朱明軍等［70］通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得了適合紅法夫酵母生長(zhǎng)的“糖蜜+硫酸銨+尿素”的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基配方，何璞等［71］利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到了蔗糖和酵母粉的最佳培養(yǎng)基，菌株產(chǎn)蝦青素含量是優(yōu)化前的近2 倍。鄭蕾［72］研究發(fā)現(xiàn)蔗糖是紅法夫酵母生長(zhǎng)的最佳碳源，葡萄糖是蝦青素在細(xì)胞內(nèi)積累的最佳碳源；最佳的氮源組成為（NH4）2SO44.9 g/L、蛋白胨6.2 g/L、酵母膏1 g/L，蝦青素的產(chǎn)量達(dá)6.78 mg/L，發(fā)酵產(chǎn)率提高了1.8 倍左右。Fang等［73］研究表明蛋白胨是最好的單一氮源，而酵母膏-牛肉膏-硝酸鉀質(zhì)量比為1∶1∶1.5的混合氮源更有利于蝦青素的積累。有研究提出以甘蔗糖蜜為主要碳源，蛋白胨為主要氮源，硝酸鉀為無(wú)機(jī)鹽，再配以生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基是適合紅法夫酵母生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)基，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，能有效提高蝦青素的產(chǎn)量［43］。Johnson等［74］探究了紅法夫酵母的基本生長(zhǎng)條件：最適培養(yǎng)溫度及色素積累溫度為20～22 ℃，適合生長(zhǎng)的最佳pH值為5.8，而蝦青素產(chǎn)率最大時(shí)的最佳pH值為5.0。杜似鵑等［75］研究表明發(fā)酵液pH 8.0、接種量20%、振蕩速率160 r/min、發(fā)酵時(shí)間168 h條件下，蝦青素產(chǎn)量最大。王立梅等［76］對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，蝦青素產(chǎn)量從5.89 mg/L提高到10.9 mg/L。劉瀅等［77］將發(fā)酵分成兩個(gè)階段，不同的階段選擇不同的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，有效提高了菌株的生物量、生長(zhǎng)速率及蝦青素產(chǎn)量。對(duì)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)組分進(jìn)行選擇和優(yōu)化是對(duì)蝦青素進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的主要前提，也是降低蝦青素生產(chǎn)成本的重要途徑之一（表3）。

研究表明，在酵母發(fā)酵過(guò)程中，向已經(jīng)確定了營(yíng)養(yǎng)組分及其配比的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加某些前體物質(zhì)或色素合成的增強(qiáng)劑如菠蘿汁、西紅柿汁、甲羥戊醛、檸檬酸、乙酸、乙醇、豆油等均可有效提高蝦青素的產(chǎn)量［51］。Johnson等［74］在紅法夫酵母的培養(yǎng)基中添加含有大量前體物質(zhì)（番茄紅素）的番茄汁，紅法夫酵母蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了814 μg/L。檸檬酸是三羧酸循環(huán)中的重要物質(zhì)，有利于提高體系中的乙酰CoA，而乙酰CoA是蝦青素生物合成的起始，因而被視為蝦青素生物合成的一種前體物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鹽，可提高蝦青素的產(chǎn)量［78］（表3）。

目前，紅法夫酵母的發(fā)酵方法主要有分批發(fā)酵、連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵、間歇補(bǔ)料發(fā)酵和兩步補(bǔ)料發(fā)酵等。分批發(fā)酵操作簡(jiǎn)單，常用于工業(yè)生產(chǎn)中。汪洪濤等［79］用甘油做碳源，以蛋白胨和酵母膏為混合氮源一次投料發(fā)酵168 h，蝦青素產(chǎn)量為33.7 mg/L。通過(guò)補(bǔ)料發(fā)酵可以實(shí)現(xiàn)酵母的高密度培養(yǎng)，高密度培養(yǎng)基本思想在于對(duì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物，在保證比生產(chǎn)率的前提下盡可能提高細(xì)胞密度，使體積生產(chǎn)率大幅提高，提高色素和菌體的生產(chǎn)效率。Vázquez等［80］在2 L發(fā)酵罐中用主要是木糖的木材水解液做碳源，在裝液量1 L，溫度22 ℃的條件下，對(duì)連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵和間歇補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明間歇補(bǔ)料發(fā)酵的生物量和蝦青素產(chǎn)量都高于連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵。間歇補(bǔ)料發(fā)酵和連續(xù)補(bǔ)料的生物量分別為30.6 g/L和10.3 g/L，蝦青素產(chǎn)量分別為30.5 mg/L和7.19 mg/L。兩步補(bǔ)料發(fā)酵是一種特殊間歇補(bǔ)料發(fā)酵。Yamane等［81］研究發(fā)現(xiàn)，在供氧量充足、含氮量固定的前提下，培養(yǎng)基中高C/N可提高蝦青素的合成速率，但低C/N卻有利于菌體的生長(zhǎng)。根據(jù)這一特點(diǎn)進(jìn)行兩步流加法發(fā)酵：第一步控制低C/N促進(jìn)菌體細(xì)胞的生長(zhǎng)；第二步流加糖提高C/N增加蝦青素的產(chǎn)量。結(jié)果生物量30 g/L，蝦青素含量0.72 mg/g，蝦青素產(chǎn)量21.6 mg/L。目前認(rèn)為通過(guò)高密度培養(yǎng)技術(shù)更有利于蝦青素的積累，因此是實(shí)現(xiàn)紅法夫酵母工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素最理想的發(fā)酵方法。高密度培養(yǎng)技術(shù)可以延長(zhǎng)微生物的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的持續(xù)時(shí)間，有效增加菌體生物量和代謝產(chǎn)物的積累。既避免了分批發(fā)酵因?yàn)橐淮瓮读线^(guò)多造成的底物抑制，葡萄糖的阻遏效應(yīng)以及因菌體生長(zhǎng)過(guò)旺而導(dǎo)致的供氧不足，又比連續(xù)發(fā)酵更易操作，更為精確，應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中可以避免原料的浪費(fèi)，縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)物的濃度，對(duì)于降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率有著深遠(yuǎn)的意義［22，44］（表3）。

表3　紅法夫酵母菌株的選育及其發(fā)酵過(guò)程的控制與優(yōu)化對(duì)蝦青素產(chǎn)量的影響Table 3 Astaxanthin productivity obtained with different strains of Xanthophyllomyces dendrorhous using low-cost raw materials， inducers，and optimal fermentation parameters

2.2.4蝦青素的提取與檢測(cè)［99-101］

蝦青素是胞內(nèi)產(chǎn)物，而酵母菌的細(xì)胞壁厚而堅(jiān)韌，給其提取造成很大障礙。因此蝦青素的提取重點(diǎn)在于酵母的破壁。破壁的方法主要有機(jī)械法、物理法、化學(xué)法和酶法4 種。

機(jī)械法是利用機(jī)械設(shè)備將細(xì)胞壁撕裂，靠胞內(nèi)滲透壓使內(nèi)含物釋放出來(lái)。目前主要有高壓均漿法、噴霧撞擊破碎法、珠磨法及超聲波破碎法。機(jī)械法操作簡(jiǎn)便而被廣泛使用，但易引起局部高溫而導(dǎo)致蝦青素氧化損失。

物理法有溫差法和壓力差法等，目前較為常用的是溫差法。物理法沒(méi)有其他物質(zhì)摻雜，不會(huì)導(dǎo)致輻射能源污染，避免了高溫和化學(xué)物質(zhì)對(duì)蝦青素的破壞。

化學(xué)法主要有酸堿加熱法、有機(jī)溶劑滲透和二甲基亞砜法等。堿提法和酸溶法需要消耗大量堿和有機(jī)酸，導(dǎo)致污水排放增加，對(duì)環(huán)境中水源污染嚴(yán)重，近幾年已逐漸退出歷史舞臺(tái)。研究發(fā)現(xiàn)酸熱法破壁所得提取液中總類胡蘿卜素濃度最高，有機(jī)溶劑滲透破壁次之，二甲基亞砜法破壁所得提取液中蝦青素濃度最高［51］。

酶法能水解細(xì)胞壁骨架成分β-葡聚糖，所以相對(duì)于其他方法能更加有效地破壁，且不使蝦青素溢出菌體避免損失。同時(shí)酶法處理?xiàng)l件溫和，提取的蝦青素比其他方法破壁提取所得蝦青素穩(wěn)定，其對(duì)設(shè)備也無(wú)需像酸法一樣有耐酸、耐高溫的特殊要求，處理過(guò)程對(duì)環(huán)境造成的污染也較小，因此是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化最為理想的方法。用于提取的一些新興的方法如負(fù)壓空化法、超臨界流體萃取法、微波處理提取法，目前也逐步開(kāi)始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

在檢測(cè)方面，層析法應(yīng)用最為廣泛，主要用到薄層層析法（thin-layer chromatography，TLC）和柱層析法，薄層層析法的分離度不高，結(jié)果受外界干擾因素大，重現(xiàn)性差，不便于實(shí)驗(yàn)操作，所以對(duì)操作過(guò)程要求極高。柱層析法是最常用的純化方法之一，與其他色譜方法相比，柱層析設(shè)備低廉，更換固定相和流動(dòng)相方便；雖然柱效不是特別高，但是利用不同固定相和流動(dòng)相的組合能夠?qū)崿F(xiàn)一些相對(duì)簡(jiǎn)單樣品的分離與純化，應(yīng)用范圍很廣。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法分離效果更好，但成本較高。與薄層層析和柱層析相比，高效液相色譜的儀器價(jià)格高昂，需要定時(shí)維修檢查，使用時(shí)對(duì)儀器的磨損度大，無(wú)法在工業(yè)中大規(guī)模普及。

3　結(jié) 語(yǔ)

目前，紅法夫酵母發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素的生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)理被逐漸闡明，在高產(chǎn)菌株的選育、培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化方面取得了較大的進(jìn)展。但是依然存在著蝦青素產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，制約了蝦青素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。要突破此瓶頸除了選育高產(chǎn)菌株，優(yōu)化發(fā)酵工藝，還應(yīng)從以下四方面進(jìn)行更為深入的研究：1）不斷完善蝦青素的生物合成途徑及代謝調(diào)控機(jī)理，特別是雨生紅球藻誘導(dǎo)積累蝦青素的具體機(jī)制，從代謝工程和系統(tǒng)生物學(xué)的角度進(jìn)行發(fā)酵菌種育種和發(fā)酵優(yōu)化；2）以現(xiàn)代分子生物學(xué)知識(shí)為理論，利用基因工程技術(shù)將蝦青素合成關(guān)鍵酶基因通過(guò)基因重組定向構(gòu)建出高產(chǎn)菌株。其載體可以是紅法夫酵母和雨生紅球藻，也可以選擇大腸桿菌和乳酸菌等細(xì)菌；3）研發(fā)新型的生物反應(yīng)器，解決高密度培養(yǎng)存在的高濃度基質(zhì)對(duì)生長(zhǎng)的抑制，高的氧需求，培養(yǎng)基的黏度不斷增加，紅法夫酵母與雨生紅球藻共有的蝦青素的積累和菌體的生產(chǎn)量呈相反趨勢(shì)等問(wèn)題；4）尋找合適的酶，使其不但能最大程度的破壁，而且可以保證蝦青素的穩(wěn)定性不被破壞，利用先進(jìn)的分離純化技術(shù)提高產(chǎn)量。

蝦青素因其獨(dú)特的生物學(xué)功能，在醫(yī)藥、高級(jí)保健品等領(lǐng)域必將有著巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景，所以實(shí)現(xiàn)蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)尤為重要，相信這四方面的研究是蝦青素未來(lái)的主要研究方向，特別是后兩方面可能成為未來(lái)解決蝦青素產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本高等問(wèn)題的關(guān)鍵技術(shù)。

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Current Status of Fermentative Production of Astaxanthin

CAI Jun， YOU Zhineng
（Key Laboratory of Fermentation Engineering， Ministry of Education， Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan430068， China）

Astaxanthin is a carotenoid that has very strong antioxidant activity， anticancer function， significant coloring capacity and immunoenhancing activity. The biological activities of astaxanthin and its applications in food， cosmetics，health products， aquaculture， medicine and other fields are summarized in this review， with focus on the current status of fermentative production of astaxanthin. Moreover， the future directions of astaxanthin research are proposed. It is expe cted that this review can provide a theoretical basis for in-depth exploration and comprehensive utilization of astaxanthin.

astaxanthin； biological activity； fermentation

TS209

A

1002-6630（2015）23-0358-09

10.7506/spkx1002-6630-201523064

2015-01-15

湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2009CDA059）

蔡俊（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：caijun@mail.hbut.edu.cn