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（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性與菌株毒力關(guān)系的研究

陳大福王吉州梁勤

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州350002）

為了探討蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）胞外蛋白酶活性（PU）與其毒力的關(guān)系，評(píng)價(jià)胞外蛋白酶活力作為毒力指標(biāo)的可靠性。本研究測(cè)定了9個(gè)不同來(lái)源地的蜜蜂球囊菌菌株的胞外蛋白酶活性及接種后各日累積蜜蜂幼蟲(chóng)死亡率和致死中時(shí)（LT50），將胞外蛋白酶活性與接種后各日累積死亡率及致死中時(shí)（LT50）進(jìn)行回歸分析，以確定胞外蛋白酶活性與其對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)的毒力間的相關(guān)性。結(jié)果表明各菌株胞外蛋白酶活性與其毒力間的存在顯著相關(guān)性。因此，蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性可作為大量菌株篩選的參考毒力指標(biāo)，但不能作為測(cè)定相關(guān)性的唯一指標(biāo)。

蜜蜂白堊病；蜜蜂球囊菌；胞外蛋白酶活性；毒力

蜜蜂白堊?。╞ee chalkbrood disease）是由蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis Olive&Spiltoir）引起的蜜蜂幼蟲(chóng)的真菌性傳染?。?］，具有很大的致病性和危害性。因此，診斷白堊病并對(duì)其加強(qiáng)防治，是發(fā)展養(yǎng)蜂業(yè)中需要緊迫解決的問(wèn)題。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)蜜蜂球囊菌的研究主要集中在病原的生物學(xué)特性［2，3］、最適培養(yǎng)條件［4，5］、發(fā)病流行規(guī)律［6-9］、病理學(xué)［10］、病情的診斷［11］等方面，但較少涉及蜜蜂球囊菌的蛋白酶特性及其毒力方面的研究。

有關(guān)胞外酶的研究，國(guó)內(nèi)外主要涉及有球孢白僵菌、綠僵菌、曲霉、黃桿菌、芽孢桿菌［12］等，蜜蜂球囊菌的胞外蛋白酶特性也有研究報(bào)道［13］，但其毒力研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)測(cè)定蜜蜂球囊菌不同菌株蛋白酶活性，分析其與毒力的關(guān)系，進(jìn)而分析評(píng)價(jià)胞外蛋白酶活力作為毒力指標(biāo)的可能性，進(jìn)一步完善蜜蜂白堊病的基礎(chǔ)研究，也可為有關(guān)蜜蜂球囊菌致病機(jī)理方面的研究提供一定的幫助。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株：本試驗(yàn)共使用了9個(gè)由福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院蜜蜂分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室自行采集、分離和保藏的蜜蜂球囊菌菌株，采集地及編號(hào)如表1。

表1　菌株采集地及編號(hào)

1.1.2酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：含1%明膠（W/V），NaCl、K2HPO4和MgSO4·7H2O三種基鹽各0.3 g/L。

1.1.3基質(zhì)液的配制：1.0 mmol/L氮-琥珀酰-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺，該化合物10 mg加入16 ml二甲基亞砜中即成。

1.2方法

1.2.1蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的培養(yǎng)

各菌株胞外蛋白酶通過(guò)搖床震蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲得。以2 ml孢子懸浮液（孢子濃度分別為106個(gè)/ml、107個(gè)/ml）接種，在35±0.5℃下震蕩（180 r/min）培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)物經(jīng)4次過(guò)濾，濾液置于4℃待酶活性測(cè)定。

1.2.2胞外蛋白酶活性的測(cè)定

參照Bidochka&Khachatourians［14］和馮明光［15］的方法，略有改變進(jìn)行測(cè)定。10 ml玻璃試管內(nèi)裝0.1 mol/ L Tris-HCl緩沖液（pH 8.5）1.8 ml和培養(yǎng)物濾液100 μl，再加入100 μl基質(zhì)液混勻，在35±0.5℃下往復(fù)式搖床震蕩（180 r/min）培養(yǎng)20 min，然后移至35±0.5℃水浴2 min。每只試管中取100 μl液樣，在OD410下分別測(cè)定吸收率。每株菌重復(fù)3次?；旌弦褐谢|(zhì)被利用1.0 μmol/min即為1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活性單位（PU）。

1.2.3菌株毒力的測(cè)定

各菌株在PDA+酵母膏培養(yǎng)基上（35±0.5℃）培養(yǎng)5～8 d，用無(wú)菌水制備孢子濃度分別為106個(gè)/ml和107個(gè)/ml的懸浮液。用細(xì)鐵絲框（10×10 cm）選取2日齡幼蟲(chóng)區(qū)標(biāo)記100巢房。每巢房?jī)?nèi)滴入（5 μl）微量孢子懸浮液為處理組。逐日觀察、記錄處理組的標(biāo)記100房區(qū)域的封蓋前幼蟲(chóng)死亡數(shù)目，直到幼蟲(chóng)封蓋，封蓋后記錄空房數(shù)目、被咬房的數(shù)目。觀察病蟲(chóng)，確定其死因，統(tǒng)計(jì)蜜蜂球囊菌致死率。每組菌做3個(gè)平行試驗(yàn)，用無(wú)菌水做對(duì)照組試驗(yàn)。

1.2.4相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)胞外蛋白酶活性的測(cè)定，比較9株蜜蜂球囊菌間胞外蛋白酶活性差異。分析不同菌株對(duì)試蟲(chóng)的死亡率，觀察開(kāi)始死亡的天數(shù)，做出其累積死亡率曲線。然后根據(jù)幾值分析法分析［16］各菌株間的毒力差異，計(jì)算真菌的LT50（致死中時(shí)）的平均值。

植物內(nèi)生菌用于果蔬采后病害防治時(shí)，需要注意很多問(wèn)題。由于植物內(nèi)生菌本身也是微生物，是否對(duì)果蔬采后生理造成一定影響，是應(yīng)用過(guò)程中需要考慮的因素；利用菌體防效的內(nèi)生菌菌體易受外界環(huán)境影響，導(dǎo)致防效不穩(wěn)定；大多內(nèi)生菌是利用抗菌活性成分防治病菌的，由于發(fā)酵周期長(zhǎng)與活性成分少，提取純化技術(shù)不成熟等因素，使植物內(nèi)生物菌生物保鮮劑多處于分離篩選和鑒定階段，防效實(shí)驗(yàn)只局限在實(shí)驗(yàn)室，成果轉(zhuǎn)化和應(yīng)用率低。

用各菌株的PU測(cè)定值分別對(duì)試蟲(chóng)的死亡率或LT50進(jìn)行回歸分析，從而評(píng)價(jià)PU作為毒力指標(biāo)的意義。

2　結(jié)果與討論

2.1胞外蛋白酶活性的測(cè)定

9個(gè)菌株的胞外蛋白酶活性略有差異。其中，孢子濃度為106個(gè)/ml蛋白酶培養(yǎng)液中，浙江嘉興ZhJ號(hào)菌株胞外蛋白酶酶活最高，福建ND-1號(hào)菌株最低；孢子濃度為107個(gè)/ml蛋白酶培養(yǎng)液中，甘肅GS-46號(hào)菌株胞外蛋白酶酶活最高，福建ND-1號(hào)菌株最低（圖1）?？梢钥闯觯S著孢子數(shù)目的增大，胞外蛋白酶活性隨之增大。菌株受環(huán)境、來(lái)源地的不同，胞外蛋白酶活性也存在差異性。

圖1　胞外蛋白酶活性的測(cè)定

2.2菌株毒力的測(cè)定

不同菌株對(duì)試蟲(chóng)的致死率如圖2、圖3所示，試蟲(chóng)一般接種后3 d開(kāi)始死亡，菌株間存在差異，蜜蜂球囊菌引起的死亡主要發(fā)生在接種后的5～11 d，毒力較弱的菌株為ND-1，較強(qiáng)的為GS-35。試蟲(chóng)在接種后10～11 d死亡率已基本穩(wěn)定。比較而言，隨著孢子數(shù)目的增多，各菌株對(duì)試蟲(chóng)的致死量相對(duì)增大，致死率高；孢子濃度為106個(gè)/ml接種11 d后蜜蜂幼蟲(chóng)死亡率仍低于50%（圖2），孢子濃度為107個(gè)/ml接種9 d后蜜蜂幼蟲(chóng)死亡率均超過(guò)50%（圖3）。

2.3蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶活性與菌株毒力相關(guān)性

根據(jù)回歸分析結(jié)果（表2），不同菌株胞外蛋白酶活性水平與蜜蜂幼蟲(chóng)接種處理后3～17 d的累積死亡率均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01），與LT50顯著負(fù)相關(guān)，表明胞外蛋白酶與毒力有關(guān)聯(lián)。但胞外蛋白酶活性與累積死亡率回歸分析的r2的變動(dòng)范圍是0.0253～0.4440，即胞外蛋白酶活性對(duì)累積死亡率的貢獻(xiàn)最大只能達(dá)到44.40%。說(shuō)明胞外蛋白酶活性雖然可以作為菌株毒力的參考指標(biāo)，但其參考價(jià)值有限。因此，用胞外蛋白酶活性測(cè)定完全替代常規(guī)毒力生物測(cè)定是不能達(dá)到滿(mǎn)意效果。

圖2　接種蜜蜂球囊菌9個(gè)不同菌株孢子懸浮液（孢子濃度為106個(gè)/ml）后蜜蜂幼蟲(chóng)的累積死亡率

表2　蜜蜂球囊菌不同菌株胞外蛋白酶活性與蜜蜂幼蟲(chóng)接種后不同時(shí)間累積死亡率及LT50的回歸分析

圖3　接種蜜蜂球囊菌9個(gè)不同菌株孢子懸浮液（孢子濃度為107孢子/ml）后蜜蜂幼蟲(chóng)的累積死亡率

2.4討論

各個(gè)菌株的LT50的平均估計(jì)值是6.92～9.04 d，菌株間毒力差異很大。作者認(rèn)為由于菌株的來(lái)源地不同，菌株間生物學(xué)勢(shì)必存在差異，且受多方面因素的影響，致使蜜蜂球囊菌對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)的致病力存在差異。蜜蜂球囊菌在蜜蜂幼蟲(chóng)3～4日齡最易感染白堊病，孢子的萌發(fā)需要厭氣條件，而菌絲的生長(zhǎng)需要好氣條件，故而3～4日齡幼蟲(chóng)的腸道厭氣時(shí)間短，適合病原菌的生長(zhǎng)特性。患白堊病的幼蟲(chóng)在封蓋后的頭兩天或者前蛹期死亡，本研究所用的9個(gè)菌株均有相似的表現(xiàn)。接種后5～11 d蜜蜂幼蟲(chóng)大量死亡，呈現(xiàn)直線上升趨勢(shì)，對(duì)于強(qiáng)毒菌株，在接種后11 d死亡率基本穩(wěn)定下來(lái)。胞外蛋白酶的分泌和作用于寄主的主要階段，應(yīng)是在病菌穿透寄主體壁的侵染期。酶活性強(qiáng)的菌株，理論上穿透體壁的時(shí)間短，成功侵染率高［15］。這是酶活性作為蜜蜂球囊菌毒力參考指標(biāo)的生物學(xué)基礎(chǔ)，也是其接種后9 d死亡率與胞外蛋白酶活性相關(guān)的直接原因。

本研究發(fā)現(xiàn)不同菌株胞外蛋白酶活性水平與蜜蜂幼蟲(chóng)接種累積死亡率均顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)，與LT50顯著負(fù)相關(guān)，表明胞外蛋白酶與毒力有關(guān)聯(lián)。由于蛋白酶僅僅是昆蟲(chóng)體壁結(jié)構(gòu)物降解酶系之一，除此之外，與體壁結(jié)構(gòu)降解物有關(guān)的其他酶系還包括幾丁質(zhì)酶、肽酶、酯酶等，并且蛋白酶和毒力之間的相關(guān)性眾說(shuō)紛紜，目前尚缺乏確定各酶之間關(guān)系的系統(tǒng)研究。所以作者認(rèn)為還需要通過(guò)大量的毒力實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析方法的改進(jìn)來(lái)進(jìn)一步明確胞外酶活性與菌株毒力之間的關(guān)系。目前蜜蜂球囊菌對(duì)蜜蜂幼蟲(chóng)體壁的侵染機(jī)理還不是十分明確，而蜜蜂球囊菌侵染機(jī)理對(duì)其毒力相關(guān)性研究尤為重要，這些都是我們?cè)谙乱徊窖芯恐行杞o予關(guān)注的。

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Study on a correlation between the activity of extracellular protease from Ascosphaera apis and its virulence

Chen Dafu Wang Jizhou Liang Qin
（College of Bee Science，F(xiàn)ujian Agriculture&Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

The correlation between the activity of extracellular proteases from Ascosphaera apis Olive&Spiltoir and its virulence was studied to evaluate for the reliability for extracellular proteases activity level to be used as a virulence index.The activity of extracellular proteases，the daily cumulative mortality of honeybee larva inoculated by A. apis，and LT50of 9 strains of A.apis from various regions in China were assayed，respectively.Correlations of extracellular proteases activity to the daily cumulative mortality after inoculation and to the LT50's were revealed by the regression analysis.Regression analysis revealed that PU was significantly correlated to the virlence of A.apis.PU can be used as virulence index only for early-stage selection of candidate isolates in large quantity and isn't the only index of correlation to the virulence assay of A.apis.

bee chalkbrood disease；Ascosphaera apis；activity of extracellular protease；virulence

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2011J01068）；國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-45-KXJ7）資助

陳大福（1973－），男，博士，副教授，主要從事蜜蜂疾病研究，E-mail：dfchen826@163.com

梁勤，E-mail：lq-fz@163.com