康曉靜劉廣勇柴 莉彭呂嬌王 朋趙 娟靳 穎

PNL2在皮膚黑素瘤的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性

康曉靜1劉廣勇2柴 莉1彭呂嬌1王 朋1趙 娟1靳 穎1

目的： 檢測PNL2在皮膚黑素瘤中的陽性表達(dá)率，明確其與預(yù)后的關(guān)系。方法： 采用免疫組織化學(xué)SP法檢測PNL2在60例皮膚黑素瘤石蠟包埋組織切片中的表達(dá)，并分析PNL2在不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、浸潤深度及預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果： PNL2在皮膚黑素瘤中的陽性表達(dá)率為90%，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、浸潤深度及預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05），與年齡、性別、民族、發(fā)病部位不相關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論： PNL2與皮膚黑素瘤的病情發(fā)展及預(yù)后具有相關(guān)性。

皮膚黑素瘤； PNL2； 侵襲； 預(yù)后

PNL2是針對(duì)黑素細(xì)胞抗原的一種新單克隆抗體。目前國內(nèi)外對(duì)PNL2的研究報(bào)道較少，與PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原尚未明確。PNL2染色不會(huì)因?yàn)榻M織標(biāo)本的漂白或脫鈣作用而改變，有利于PNL2對(duì)發(fā)生于高度染色細(xì)胞組織病變的黑素瘤和發(fā)生骨轉(zhuǎn)移病變黑素瘤進(jìn)行免疫檢測的診斷。PNL2在黑素瘤診斷中顯示出高度靈敏度和特異性，對(duì)診斷黑素瘤具有很大價(jià)值。1，2目前，黑素瘤中PNL2表達(dá)情況與黑素瘤臨床表型的相關(guān)性研究甚少。本研究用免疫組化方法檢測60例皮膚黑素瘤組織中 PNL2的表達(dá)，探討PNL2的表達(dá)與皮膚黑素瘤的診斷、臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系及意義。

1　資料與方法

1.1研究病例 60例明確診斷為皮膚黑素瘤的石蠟包埋組織均選取新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院病理科及皮膚科2004年1月至2013年12月存檔蠟塊，病史完整。所有標(biāo)本均經(jīng)HE及病理診斷證實(shí)。60例皮膚黑素瘤患者均未做化療、放療及抗免疫治療。其中維吾爾族29例，漢族31例；男32例，女28例；年齡22～94歲，平均57.5歲；肢端型42例，非肢端型18例；浸潤深度：組織學(xué)表現(xiàn)為原位皮膚黑素瘤（腫瘤細(xì)胞未突破基底膜）16例，侵襲性皮膚黑素瘤（腫瘤細(xì)胞突破基底膜向真皮內(nèi)侵襲）44例。組織學(xué)Clark分級(jí)：I-III級(jí)17例，IV-V級(jí)43例；伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；3年內(nèi)隨訪出現(xiàn)多器官轉(zhuǎn)移或死亡29例，預(yù)后良好14例，失訪17例。

主要試劑 一抗是小鼠抗人皮膚黑素瘤PNL2單克隆抗體（IgG，產(chǎn)地英國，產(chǎn)品編號(hào)：ab12502）；鼠兔通用型二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑均購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.2方法 免疫組織化學(xué)法將10%福爾馬林固定、石蠟包埋的皮膚黑素瘤組織制成4～5μm切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化；浸入0.01 mol/L，pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)，熱抗原修復(fù)3 min；3%H2O2室溫作用10min以消除內(nèi)源性過氧化氫酶；滴加一抗（稀釋度為1∶800）；4℃過夜后在室溫復(fù)溫20 min后滴加1 mmol EDTA緩沖液，滴加一抗（稀釋度為1∶10-1∶25）調(diào)pH值為9.0的稀釋液中進(jìn)行原位染色，熱抗原修復(fù)3min；室溫孵育30～60 min；DAB顯色1 min左右；自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，通透、脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。PBS代替一抗作為空白對(duì)照，已知PNL2染色陽性的皮膚黑素瘤切片作為陽性對(duì)照。

結(jié)果判斷：所有切片做免疫組化前均現(xiàn)切現(xiàn)用，所有免疫組化結(jié)果由2位病理科專家雙盲閱片判讀結(jié)果，PNL2陽性染色為棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。觀察全片，借助高分辨顯微鏡隨機(jī)取不重疊的5個(gè)200倍視野，得出陽性細(xì)胞所占百分比。采用半定量積分法，對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)計(jì)分。染色強(qiáng)度分為3級(jí)：無著色0分，淺著色1分，棕黃色2分；按陽性細(xì)胞百分比分4級(jí)：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。每張切片最后的得分為兩次評(píng)分的乘積：≥3分是陽性，＜3分是陰性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS l7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)四格表確切概率法分析皮膚黑素瘤中與不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)、浸潤深度及預(yù)后中PNL2表達(dá)的差異，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PNL2在皮膚黑素瘤組織中表達(dá)分析 60例皮膚黑素瘤石蠟包埋組織中，PNL2陽性表達(dá)54例，表現(xiàn)為胞漿的棕黃色顆粒狀著色，表達(dá)率為90%（54/ 60）（圖1）。

圖1　PNL2表達(dá)陽性：細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒（HE，a×100，b×400）

2.2皮膚黑素瘤組織中PNL2的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 PNL2陽性表達(dá)的皮膚黑素瘤組織與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Clark分級(jí)及預(yù)后存在差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且PNL2的陽性表達(dá)率隨皮膚黑素瘤組織Clark分級(jí)升高及浸潤深度加深而增高。見表1、2。PNL2的陽性率表達(dá)在不同年齡、性別、民族、發(fā)病部位之間分布無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1　皮膚黑素瘤PNL2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表2　皮膚黑素瘤PNL2表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系

3　討論

生物學(xué)標(biāo)記物是近年來醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域上的熱點(diǎn)。大多數(shù)的黑素瘤標(biāo)記物其靈敏度和特異性有限。探索黑素瘤的病因及發(fā)病機(jī)制，以期找到黑素瘤早期有效診斷指標(biāo)及分子靶向治療方法已成為目前治療黑素瘤中迫切的問題。

PNL2單克隆抗體是相對(duì)較新的黑素瘤標(biāo)記物，目前認(rèn)為可作為轉(zhuǎn)移性黑素瘤診斷的補(bǔ)充標(biāo)記物。最初，PNL2是以人生長抑素受體為抗原而生產(chǎn)的單克隆抗體，理論上該重組蛋白可以與人生長抑素受體第2亞型（SST2）的羧基端相結(jié)合。最終發(fā)現(xiàn)PNL2不能與SST2相結(jié)合，但可以與黑素細(xì)胞和粒細(xì)胞中的某種未知抗原相結(jié)合。3目前與PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原尚未明確，但資料顯示PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原與HMB -45/MelanA相對(duì)應(yīng)的抗原 PMEL17/gp100是不同的。4有猜測是與PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原具有與TAP1或網(wǎng)格蛋白17相同的分子量，而被這些大量的蛋白所掩蓋。5PNL2對(duì)黑素瘤具有高度特異性。Busam等1對(duì)38例黑素瘤樣本研究發(fā)現(xiàn)PNL2陽性表達(dá)率為87%、Melan-A陽性率為82%、HMB-45陽性率為76%、酪氨酸酶陽性率為92%、MITF陽性率為82%。Rochaix等5對(duì)49例黑素瘤樣本進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PNL2陽性表達(dá)率為94%、Melan-A為90%、HMB-45為90%。在這些樣本中PNL2比HMB-45具有更強(qiáng)的一致性和陽性表達(dá)率，在49個(gè)樣本中有1例黏膜黑素瘤PNL2呈陽性表達(dá)。本研究顯示60例皮膚黑素瘤樣本中PNL2的陽性表達(dá)率高達(dá)90%（54/60），進(jìn)一步說明PNL2對(duì)皮膚黑素瘤具有高度靈敏性。PNL2更易染色于真表皮連接處和上皮樣黑素瘤。另外PNL2也是血管周上皮樣細(xì)胞腫瘤的很好的補(bǔ)充標(biāo)記物。

PNL2僅染色于黑素細(xì)胞病變、透明細(xì)胞肉瘤、黑素性神經(jīng)鞘瘤、血管肌脂肪瘤和淋巴管肌瘤病，而其他非黑素細(xì)胞腫瘤的研究均為陰性。6PNL2與MelanA，HMB-45抗體有著相似的特異性，但PNL2著色強(qiáng)度及一致性都強(qiáng)于HMB-45抗體。同時(shí)HMB-45表現(xiàn)陰性的黑素瘤在PNL2表現(xiàn)出強(qiáng)陽性。7Aung等8研究發(fā)現(xiàn)214例轉(zhuǎn)移性黑素瘤中PNL2陽性表達(dá)率為89%（190/214），其中對(duì)KBA62、S100、HMB45、MelanA、MITF及酪氨酸酶呈陰性反應(yīng)的黑素瘤中PNL2的陽性表達(dá)率分別為83%（25/30）、70%（7/10）、25%（7/28）、44%（12/27）、52%（16/31）及25%（4/16）。除了上述S100標(biāo)記物外對(duì)剩余的標(biāo)記物全部顯示陰性的黑素瘤標(biāo)本中PNL2陽性反應(yīng)率為10%（1/10）。PNL2在淋巴管肌瘤病，血管平滑肌脂肪瘤非黑素細(xì)胞病變著色仍強(qiáng)于 HMB-45抗體。9進(jìn)一步說明PNL2對(duì)黑素瘤的診斷具有優(yōu)越性。

有報(bào)道稱與HMB-45和Melan-A相比，PNL2對(duì)黑素瘤具有更高的特異性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于S-100。目前對(duì)PNL2在黑素瘤免疫反應(yīng)的調(diào)查結(jié)果顯示PNL2是一種具有高度靈敏性和特異性的黑素瘤標(biāo)記物，其在大多數(shù)原發(fā)性上皮樣黑素瘤中常呈陽性反應(yīng)（78%～100%）。1，3，5在轉(zhuǎn)移性黑素瘤中陽性反應(yīng)率約為75%～100%。1，5，8非促結(jié)締組織增生梭形細(xì)胞黑素瘤也常呈陽性反應(yīng)（80%）。1類似于其它黑素瘤標(biāo)記物，PNL2陽性反應(yīng)也可見于透明細(xì)胞瘤5，8、腎血管平滑肌脂肪瘤5、淋巴管肌瘤病5、黑素細(xì)胞性神經(jīng)鞘瘤。1，5其它所有的非黑素細(xì)胞腫瘤的研究包括各種類型的腫瘤、軟組織癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、嗜絡(luò)細(xì)胞瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤其PNL2反應(yīng)為陰性。1，5，8

Clark分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度是影響黑素瘤預(yù)后的重要因素。本研究顯示PNL2陽性表達(dá)的皮膚黑素瘤患者多伴隨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且皮膚黑素瘤PNL2陽性表達(dá)率隨Clark分級(jí)升高及浸潤深度加深而增高。PNL2陽性表達(dá)與預(yù)后具有高度相關(guān)性，有望成為一個(gè)重要的皮膚黑素瘤預(yù)后預(yù)測指標(biāo)。本研究及其他文獻(xiàn)研究顯示的PNL2在皮膚黑素瘤中陽性高表達(dá)，說明PNL2對(duì)皮膚黑素瘤具有高度靈敏性和特異性，提示PNL2可作為皮膚黑素瘤臨床診斷潛在的補(bǔ)充標(biāo)記物。

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9Giudice C，Ceciliani F，Rondena M.Immunohistochemical investigation of PNL2 reactivity of canine melanocytic neoplasms and comparison with melan a.JVet Diagn Invest，2010，22（3）：389-394.

（收稿：2015-05-05 修回：2015-06-04）

The expression of PNL2 and the correlation with prognosis ofmelanoma

KANG Xiao-jing，LIUGuang-yong，CHAILi，etal.DepartmentofDermatology，People'sHosptilalofXinjiang Uyqur Autonomous Kegion

Objective：To detect the expression of PNL2 in cutaneousmalignantmelanoma（MM）and to determine the relationship with the disease progression and prognosis.M ethods：The expression of PNL2 in paraffin-embedded tissue samples from 60 cases of MM was detected with immunohistochemistry.The correlation between PNL2 expression and age，gender，ethnicity，pathogenic site，lymph node metastasis，Clark grade，infiltration and prognosiswas analyzed.Results：The positivity rate of PNL2 was90%inmelanoma tissue.The PNL2 expression was positively correlated with lymph nodemetastasis，Clark grade，depth of invasion and prognosis（P＜0.05），but uncorrelated with age，gender，ethnicity and pathogenic site（P＞0.05）. Conclusion：PNL2 is correlated with the disease progression and prognosis in cutaneous MM.

melanoma；PNL2；invasion；prognosis

烏魯木齊市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：G131310001）

國家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目經(jīng)費(fèi)資助

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科，烏魯木齊，830001

2山東省聊城市第二人民醫(yī)院風(fēng)濕科，聊城，252000