石學慧　張素蘭　曹夏　王凌燕　段霞　劉未艾　張志萍△

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

·研究報告·

巨刺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響*

石學慧1張素蘭2曹夏2王凌燕2段霞2劉未艾1張志萍1△

（1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208）

目的觀察巨刺對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機制。方法雄性SD大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、假手術組、模型組、健側針刺（即巨刺法）組、患側針刺組。各組再分為3 d和14 d兩個亞組。采用改良線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型。于再灌注24 h后，健側針刺組針刺人中、百會及電針健側穴位；患側針刺組針刺人中、百會及電針患側穴位。電針選用疏密波，每次持續(xù)刺激30 min，每日1次。分別于3 d和14 d光鏡下觀察大鼠缺血腦組織結構；采用免疫組化法（S-ABC法）測定大腦皮質(zhì)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達的變化。結果針刺治療后大鼠缺血區(qū)腦組織損傷程度明顯改善，其中健側針刺組較患側針刺組改善明顯；健側針刺組、患側針刺組VEGF及Ang-1的表達均較模型組增多（P＜0.05）；而健側針刺組的表達較患側針刺組顯著增多（P＜0.05）。結論巨刺能夠明顯改善再灌注損傷大鼠缺血區(qū)腦組織損傷程度，其機制可能與上調(diào)腦組織VEGF和Ang-1表達有關。

巨刺腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長因子血管生成素-1腦組織

近年來我國缺血性腦血管病發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢，且致殘率居高不下。研究表明，缺血缺氧刺激和臨床溶栓藥物的使用在血管再通、血流供應恢復的同時往往帶來再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織恢復血供后，腦組織損傷反而進一步加重。針灸不僅能治療缺血性腦病，而且對防治腦缺血再灌注損傷方面也取得了一定成效［1］。巨刺治療中風偏癱古已有之，現(xiàn)代報道亦療效滿意，并且具有普通針刺所不具備的可配合運動療法、不加重患側痙攣程度等優(yōu)點。然而相關實驗研究較少，缺乏客觀的指標說明其治療機制。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后微血管新生促進血流恢復和氧供的同時為神經(jīng)再生和突觸發(fā)生創(chuàng)造了條件，影響神經(jīng)功能恢復，也決定著預后。而血管生成與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血管生成素（Ang）這兩種主要的促血管生成因子密切相關。VEGF作用于血管形成早期，促進原始血管網(wǎng)形成；Ang則作用于隨后的血管改建，促進形成成熟的血管網(wǎng)。因此本實驗觀察巨刺對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和血管生成素-1（Ang-1）蛋白表達的影響，探討巨刺治療腦缺血再灌注損傷可能的作用機制。現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1動物清潔級健康SD雄性大鼠140只，體質(zhì)量（260±20）g，湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，在實驗前與實驗中分批購入，動物合格證號：SCXK（湘）2013-0004，飼養(yǎng)溫度20～25℃，相對濕度50%～70%。

1.2實驗材料電針儀，M6805-Ⅰ型；華佗牌31號0.5寸無菌針灸針；VEGF、Ang-1免疫組化（S-ABC法）試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3模型制備造模方法參照Zea Longa線栓法制備模型［2］，栓塞2 h后拔出魚線再灌注。假手術組不阻塞大腦中動脈，插線深度5 mm左右，其余手術步驟同模型組。造模動物在自然蘇醒后，按照Zea-Longa神經(jīng)缺損體征評分標準評分［2］。造模后即刻評分，為1～3分者納入實驗，未達標準者剔除。

1.4分組與干預采用隨機數(shù)字表法分為空白組、假手術組各20只；造模組60只，造模后再分為模型組、健側針刺組、患側針刺組；各組再分為3 d亞組和14 d亞組，各10只；其余40只備用。空白組、假手術組、模型組正常喂養(yǎng)3 d和14 d。健側針刺組（即巨刺組）針刺人中、百會及健側肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療；患側針刺組針刺人中、百會及患側肢體曲池、合谷、足三里、三陰交行電針治療。取穴定位、針刺深度均參照中國針灸學會實驗針灸研究會華興邦等制定的《常用動物腧穴圖譜》［3］。電針治療波形選用疏密波，電流強度1 mA，以大鼠觸須、耳朵微動為度，每次持續(xù)刺激30 min。在缺血再灌注24 h后行第1次電針治療，每日1次。

1.5標本采集與檢測每組大鼠分別于3 d和14 d行最后一次治療后取材，深度麻醉后以預冷的0.9%氯化鈉注射液左心室灌流沖洗，換經(jīng)預冷的4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，制備石蠟切片，取大腦皮質(zhì)缺血區(qū)為觀察部位，以相鄰切片用于HE染色和免疫組化。HE染色后于400倍光鏡下觀測各組皮質(zhì)區(qū)缺血腦組織形態(tài)學改變。免疫組化檢測腦組織缺血區(qū)及周圍VEGF、Ang-1的表達情況：免疫組化步驟按照試劑盒說明書進行操作。結果判定以胞漿染成棕黃色為陽性細胞。每例大鼠選3張切片，每張切片隨機選3個視野進行攝像（400倍），用IPP6.0圖像處理分析軟件分別對VEGF、Ang-1的陽性細胞的平均光密度進行分析。

1.6統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（±s）表示，均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，各組組間差異采用單因素方差分析，若方差齊時采用LSD檢驗，不服從正態(tài)性和（或）方差不齊時用非參數(shù)檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組腦組織常規(guī)病理染色結果見圖1。空白組、假手術組大腦皮質(zhì)：細胞層次整齊，結構完整，具有完整細胞核和豐富的胞漿，染色均勻。模型組大腦皮質(zhì)：細胞數(shù)顯著減少，細胞層次模糊、不完整，排列疏松，細胞形態(tài)腫脹不規(guī)則，梗死灶邊緣可見壞死細胞。健側針刺組：細胞數(shù)多于模型組，層次豐富，排列緊密，部分神經(jīng)細胞完整，壞死細胞數(shù)量較模型組明顯減少?；紓柔槾探M：與健側針刺組比較，組織結構較疏松，間質(zhì)稍見水腫，壞死細胞數(shù)量較健側針刺組稍多。

圖1　光鏡下各組大鼠缺血腦組織結構（400倍）

2.2各組動物VEGF和Ang-1表達水平比較見表1。空白組、假手術組的腦缺血及周圍組織均有少量VEGF和Ang-1表達，兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與空白組、假手術組相比，其他3組的VEGF、Ang-1表達均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，健側針刺組和患側針刺組VEGF、Ang-1表達較前者上升（P＜0.05）；健側針刺組與患側針刺組相比，前者優(yōu)于后者（P＜0.05）。

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質(zhì)VEGF、Ang-1蛋白表達的比較（±s）

表1　各組大鼠3 d、14 d后大腦皮質(zhì)VEGF、Ang-1蛋白表達的比較（±s）

與空白組、假手術組比較，△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；與健側針刺組比較，☆P＜0.05。

組別n空白組10假手術組10模型組10健側針刺組10患側針刺組10 3 d亞組0.138±0.035 0.124±0.031 0.260±0.052△0.375±0.064△*0.316±0.066△*☆14 d亞組0.132±0.026 0.141±0.036 0.242±0.052△0.359±0.065△*0.298±0.063△*☆

3　討論

“巨刺”首見于《內(nèi)經(jīng)》，屬于九刺法之一。早在元代杜思敬的《濟生拔粹·針經(jīng)摘英集》就有關于巨刺治療腦卒中的明確記載。中醫(yī)學認為缺血性中風是由于氣血瘀滯、腦脈痹阻、竅閉神匿、肌膚筋脈失于濡養(yǎng)，肢體失用所致。而巨刺法是運用全身經(jīng)絡系統(tǒng)相互溝通、聯(lián)系的特點，通過刺激健側經(jīng)絡，調(diào)動正氣，借健側經(jīng)絡間接達到疏通患側氣血，改善患側肢體經(jīng)絡阻滯不通、針感較差、不容易得氣的特點。因此，本實驗以針刺健側肢體作為實驗組，以針刺患肢作對照。通過人中、百會醒腦調(diào)神導氣；內(nèi)關調(diào)理心神、疏通氣血；曲池疏通肢體經(jīng)絡；足三里補虛健運、調(diào)和氣血；三陰交補三陰、益肝腎、調(diào)氣血。根據(jù)經(jīng)絡理論，人體經(jīng)絡系統(tǒng)是通過臟腑組織和奇經(jīng)八脈相互溝通，且部分經(jīng)絡左右交叉。因此，左右側經(jīng)絡在生理上是互相聯(lián)系，在病理上是相互影響?，F(xiàn)代解剖學同樣可以為巨刺治療中風偏癱提供理論依據(jù)［4］。

缺血性腦血管病的現(xiàn)代醫(yī)學治療主要有超早期溶栓治療、保護神經(jīng)細胞，其目的在于盡快恢復血供和重建神經(jīng)結構。而神經(jīng)細胞的增殖并不是單獨發(fā)生的，神經(jīng)前體細胞的增殖與血管的生成密切相關。因此通過對血管再生的研究就可以大致了解和掌握神經(jīng)元再生的情況。VEGF是已知的促進血管生長作用最強的細胞因子，VEGF/VEGFR系統(tǒng)激活使內(nèi)皮細胞增生并誘導新生血管形成，增加受累腦組織再灌注及供氧量，從而減輕缺血再灌注損傷。Ang-1可以抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡，減輕腦缺血后血腦屏障的滲漏從而減少梗死體積，促進血管內(nèi)皮細胞的出芽與遷移。研究表明，針灸治療缺血性腦病具有促進血管新生的作用［5］。因此，本研究以VEGF、Ang-1為檢測指標。而局灶性腦缺血大鼠缺血腦組織VEGF在缺血第3日達高峰［6］。Ang-1于第14日達高峰［7］。故本實驗分別于3 d和14 d檢測缺血腦組織VEGF、Ang-1的表達水平。實驗觀察到，手術創(chuàng)傷對腦內(nèi)血管內(nèi)皮細胞VEGF及Ang-1的表達無明顯影響；模型組VEGF及Ang-1的表達上升，說明腦缺血時，腦組織在一定程度上會自發(fā)性地出現(xiàn)血管新生，這與劉媛媛等的研究結果相一致［8］；健側針刺組、患側針刺組VEGF及Ang-1的表達均較模型組明顯增多，而健側針刺組較患側針刺組明顯，說明針刺可以改善腦缺血再灌注損傷大鼠缺血腦組織損傷程度，實現(xiàn)對腦缺血損傷的保護作用，而巨刺的效果更明顯。巨刺可調(diào)節(jié)促血管生成相關因子，改善腦缺血后病側腦的血液循環(huán)，通過促進內(nèi)皮細胞增生并誘導內(nèi)皮細胞遷移，新生血管形成，改善腦病灶及周圍腦細胞的營養(yǎng)，從而改善缺血區(qū)腦組織的損傷程度。其作用可能是通過上調(diào)VEGF、Ang-1來實現(xiàn)的，這可能是巨刺治療腦缺血再灌注損傷的機制之一。本實驗結果與文獻報道相符合［9］。但有文獻報道VEGF也增加血管的通透性，可以導致腦水腫進而加重缺血性腦損害［10］。因此，巨刺的作用機制可能是多層次的，具體是哪些因子在起主導作用，又或是抑制了哪些細胞因子，有待進一步的研究。本研究提示了針刺與VEGF、Ang-1可能存在必然聯(lián)系，從血管生成的角度初步探討巨刺治療缺血再灌注損傷的作用機制，為進一步探索巨刺的作用機制提供實驗依據(jù)。

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Effects of Opposing Needling on the Expression of VEGF and Ang-1 in Brain Tissue in Rats with Focal Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

SHI Xuehui，ZHANG Sulan，CAO Xia，et al.The Second Affiliated Hospital，Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410005，China

Objective：To observe the effects of opposing needling on the expression of VEGF and Ang-1 in brain tissue in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury and explore the possible mechanism of the opposing needling for treating rats with focal cerebral ischemia-reperfusion injury.Methods：One hundred SD male rats were randomly divided into the blank group，the sham-operated group，the model group，the unaffected-side acupuncture group（opposing needling group）and the affected-side acupuncture group，with twenty rats in each group.And groups were divided into 3d subgroup and 14d subgroup.The model of focal cerebral ischemia-reperfusion was established by inserting nylon thread into the internal carotid artery.Twenty-four hours after reperfusion，Unaffected-side acupuncture group，as well as Affected-side acupuncture group，was treated with"renzhong"，"baihui"and electro-acupuncture.Electro-acupuncture was chosen with constant stimulation of the density wave for thirty minutes every day.The ultrastructure of brain tissue on 3 rd and 14 th day after focal cerebral ischemia reperfusion was observed with the optical microscope.And the expression of VEGF and Ang-1 in cerebral cortex tissue was detected with immunehistochemical method.Results：The degree of ischemic brain tissue damage in rats was improved significantly after acupuncture.But the unaffected-side acupuncture group had an more obvious improvement than that of the affected-side acupuncture group.In comparison with the sham group，the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group and affected-side acupuncture group increased significantly（P＜0.05）.And the expression of VEGF and Ang-1 in unaffected-side acupuncture group was more than that in the affected-side acupuncture group（P＜0.05）.Conclusion：Opposing needling can greatly improve the injury of ischemia reperfusion of brain tissue in rats，which may be related to its effect in up regulating VEGF an-d Ang-1 after the ischemia-reperfusion injury.

Opposing needling；Ischemia-reperfusion；VEGF；Ang-1；Brain tissue

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1525-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.007

2015-04-22）

湖南省科技計劃項目（S2014S2033）

（電子郵箱：1617564871@qq.com）