侯斌　張樹(shù)泉　陳再林

（1.山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安271000；2.湖南省瀏陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖南瀏陽(yáng)410300）

·研究報(bào)告·

補(bǔ)腎活血化痰方對(duì)腦出血大鼠腦組織MMP-9表達(dá)及血清NSE的影響*

侯斌1張樹(shù)泉1陳再林2

（1.山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安271000；2.湖南省瀏陽(yáng)市中醫(yī)醫(yī)院，湖南瀏陽(yáng)410300）

目的觀察補(bǔ)腎活血化痰方對(duì)大鼠腦出血后腦組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)及血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）的影響。方法采用自體不凝血注入尾狀核法制備腦出血模型。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、補(bǔ)腎活血化痰方組，假手術(shù)組和模型組每日給予生理鹽水灌胃，補(bǔ)腎活血化痰方組給予補(bǔ)腎活血化痰方煎劑。各組分別在腦出血術(shù)后24、48、72、120 h各個(gè)時(shí)點(diǎn)取血，留取腦組織標(biāo)本。于各時(shí)點(diǎn)觀測(cè)大鼠腦含水量，用免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織MMP-9的表達(dá)水平，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中NSE的含量。結(jié)果補(bǔ)腎活血化痰方組各時(shí)點(diǎn)腦含水量明顯低于模型組（P＜0．05），各時(shí)點(diǎn)腦組織MMP-9陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯減少（P＜0．01），血清NSE水平在48、72、120 h時(shí)較模型組顯著降低（P＜0．01）。結(jié)論補(bǔ)腎活血化痰方能減輕腦水腫，減輕腦組織損傷，其作用可能和有效抑制腦出血大鼠腦組織MMP-9表達(dá)，降低血清NSE水平有關(guān)。

補(bǔ)腎活血化痰方腦出血基質(zhì)金屬蛋白酶-9神經(jīng)元特異性烯醇化酶

腦出血后的腦水腫導(dǎo)致腦組織損傷和神經(jīng)功能改變，顱內(nèi)壓增高嚴(yán)重時(shí)可以形成腦疝，這是腦出血高死亡率、高致殘率的重要原因。近年研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）參與了血腦屏障的損害過(guò)程，其中MMP-9在血腦屏障的破壞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，與腦出血及腦水腫關(guān)系密切［1］。神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的烯醇化酶，NSE升高標(biāo)志神經(jīng)元損傷。前期研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血化痰方治療急性期出血療效肯定［2］，但機(jī)制尚不完全清楚。為了進(jìn)一步探討補(bǔ)腎活血化痰方治療急性期腦出血的可能作用機(jī)制，筆者復(fù)制了急性期腦出血大鼠模型，就補(bǔ)腎活血化痰方對(duì)大鼠腦出血后腦組織MMP-9表達(dá)及血清NSE的影響進(jìn)行研究，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及分組選取健康、成年SD雄性大鼠96只，由山東省泰山醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量250～300 g，飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，20～25℃環(huán)境飼養(yǎng)。將其隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)腎活血化痰方組，每組各32只。

1.2試劑及儀器MMP-9免疫組化檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），NSE試劑盒（上海拜力生物科技有限公司）；立體定位儀（華北生物儀器設(shè)備有限公司）；JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；MIAS醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)（北航公司）。

1.3模型制備采用自體血注入尾狀核法建立大鼠腦出血模型。大鼠術(shù)前8h禁食，4h禁水，10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。將大鼠俯臥固定于立體定向儀上，門齒溝水平比耳間線低2.4 mm；頭頂常規(guī)備皮，消毒，正中切口10 mm，沿矢狀縫切開(kāi)頭皮，使前囟及冠狀縫暴露，參照Rosenberg等［3］方法，于前囟前0.5mm，中線右側(cè)旁開(kāi)3 mm，用牙科鉆鉆一直徑約3 mm的圓孔，深度達(dá)硬腦膜表面，不傷及腦組織。用1 mL注射器經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈導(dǎo)管針抽取新鮮自體血100 μL，用微量注射泵將40 μL自體血經(jīng)注血針緩慢注入到右側(cè)尾狀核內(nèi)，注血完畢后，原位留針20 min，緩慢拔針，縫合皮膚，麻醉蘇醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀視為造模成功。假手術(shù)組僅用空針穿刺，但不注血，留針時(shí)間相同。

1.4給藥方法補(bǔ)腎活血化痰方由制首烏、山茱萸、山藥、麥冬、五味子、菖蒲、郁金、茯苓、三七、當(dāng)歸、川芎、丹參、益母草等組成，煎制、濃縮至每毫升含生藥1.1 g（由山東省泰安市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備）。補(bǔ)腎活血化痰方組予中藥液1.2 mL/100 g，模型組和假手術(shù)組予等量生理鹽水。造模成功后3 h開(kāi)始給藥，每日灌胃1次，直至24、48、72、120 h各時(shí)點(diǎn)處死取材。

1.5標(biāo)本采集及檢測(cè)各組分別在腦出血術(shù)后24、48、72、120 h各個(gè)時(shí)點(diǎn)處死8只，留取標(biāo)本。1）腦組織含水量。乙醚麻醉后，迅速斷頭取腦，距離針道前后1.5 mm冠狀切取腦組織。取血腫邊緣部分腦組織0.2 g左右，控制在5 min內(nèi)完成，將標(biāo)本放于100℃烘箱中烘干24 h至恒質(zhì)量，再稱干質(zhì)量。按Billiot公式計(jì)算腦組織含水量：腦組織含水量=（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/濕質(zhì)量×100%。以ng/mg表示腦組織濕質(zhì)量。2）免疫組化SABC法檢測(cè)腦組織MMP-9的表達(dá)水平。以針眼為中心取血腫周邊腦組織約200 mg，常規(guī)脫水，石蠟切片60℃脫蠟過(guò)夜；二甲苯、梯度乙醇脫蠟，蒸餾水沖洗，3%雙氧水37℃浸泡消除過(guò)氧化物酶，PBS沖洗，抗原熱修復(fù)，滴加兔抗鼠MMP-9抗體，孵育2 h，沖洗，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗，放置濕盒中，沖洗，孵育，DAB顯色，洗滌，蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸酒精分化中性樹(shù)脂封片，顯微鏡觀察，照片，留存。所有圖像結(jié)果用計(jì)算機(jī)MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)。切片于光鏡下400倍放大，隨機(jī)選取5個(gè)視野，測(cè)定MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)面積即目標(biāo)面積與總統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的比值即面密度（%）。陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞膜或胞漿著色呈棕黃色。3）血清NSE水平檢測(cè)。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)末次給藥30 min后，10%水合氯醛腹腔麻醉，用注射器經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈導(dǎo)管針抽取新鮮血4 mL送實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法對(duì)NSE水平進(jìn)行測(cè)定。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS18.0醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以（±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析，組間比較用SNK（Student-Newman-Keuls）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦含水量的變化見(jiàn)表1。結(jié)果表明，假手術(shù)組個(gè)時(shí)間點(diǎn)腦含水量無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)腦水腫。模型組和補(bǔ)腎活血化痰方組腦含水量在各時(shí)點(diǎn)均較假手術(shù)組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在72 h時(shí)達(dá)到高峰。補(bǔ)腎活血化痰方組與模型組相比較，腦含水含量明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明補(bǔ)腎活血化痰方針對(duì)腦出血后減少腦水腫含量作用顯著。

表1　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦含水量比較（%，±s）

表1　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦含水量比較（%，±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05。下同。

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術(shù)組8模型組8 71.08±0.9771.32±1.5970.93±1.3270.21±1.21 77.12±1.09*79.39±2.01*81.71±1.09*75.57±1.69*補(bǔ)腎活血化痰方組874.11±1.16*△76.39±1.07*△77.68±0.92*△71.78±1.52*△

圖1　MMP-9免疫組化染色（400倍）

2.2各組腦出血后大鼠腦組織MMP-9的表達(dá)比較見(jiàn)圖1，表2。免疫組化染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時(shí)點(diǎn)見(jiàn)極少量MMP-9陽(yáng)性表達(dá)；模型組、補(bǔ)腎活血化痰方組大鼠腦組織均可見(jiàn)染成棕黃色的MMP-9陽(yáng)性表達(dá)信號(hào)，以胞質(zhì)內(nèi)為主，細(xì)胞間質(zhì)也可見(jiàn)少量陽(yáng)性表達(dá)，72 h時(shí)達(dá)高峰，染色強(qiáng)度加深，呈深棕色，120 h時(shí)表達(dá)回落，與假手術(shù)組相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而與模型組比較，補(bǔ)腎活血化痰方組在各時(shí)點(diǎn)MMP-9陽(yáng)性染色面積/總統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積，即面密度均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），至72 h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)相差最為明顯。

表2　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織MMP-9表達(dá)比較（%，±s）

表2　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織MMP-9表達(dá)比較（%，±s）

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術(shù)組8模型組8 10.01±0.8710.97±1.0910.39±1.7710.26±1.35 68.12±2.59*78.39±1.51*85.27±3.16*58.19±2.01*補(bǔ)腎活血化痰方組845.72±3.19*△51.37±2.07*△60.19±2.95*△39.61±2.76*△

2.3各組大鼠各時(shí)點(diǎn)血清NSE水平比較見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，模型組和補(bǔ)腎活血化痰方組NSE水平在各時(shí)點(diǎn)均較假手術(shù)組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。補(bǔ)腎活血化痰方組與模型組相比較，在24 h時(shí)血清NSE水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在48、72、120 h時(shí)明顯低于模型組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），結(jié)果表明補(bǔ)腎活血化痰方可降低血清NSE水平，針對(duì)腦出血后腦組織損傷的保護(hù)作用效果顯著。

表3　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)血清NSE水平比較（μg/L，±s）

表3　各組腦出血后不同時(shí)間點(diǎn)血清NSE水平比較（μg/L，±s）

組別n 24 h48 h72 h120 h假手術(shù)組8模型組8 5.57±1.025.61±1.525.59±1.375.72±1.26 18.05±2.19*20.76±1.37*25.17±3.81*21.78±2.06*補(bǔ)腎活血化痰方組817.32±1.76*15.18±2.59*△16.49±1.78*△15.72±1.97*△

3　討論

大量實(shí)驗(yàn)表明，腦出血造成的神經(jīng)功能障礙與腦水腫及繼發(fā)的腦組織損傷密切相關(guān)［4］。MMP-9是MMPs家族中分子量最大的明膠酶，與腦組織損傷關(guān)系最為密切［5］。MMP-9可降解ECM中的Ⅳ型膠原、V型膠原酶、纖黏蛋白、彈性蛋白、層黏素等，可破壞腦基底膜的完整性，導(dǎo)致血腦屏障破壞，為炎性細(xì)胞向腦組織浸潤(rùn)提供條件，進(jìn)一步加重腦組織水腫及神經(jīng)細(xì)胞損傷，是判斷腦出血后血腫周圍腦水腫嚴(yán)重程度及預(yù)后的重要指標(biāo)。

NSE是一種參與糖酵解烯醇化酶的亞型，主要存在于大腦神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞損傷或壞死后NSE從損傷的神經(jīng)細(xì)胞漏出，通過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦脊液和血液。其對(duì)神經(jīng)元損害極為敏感，是神經(jīng)元損害的標(biāo)志酶［6］，可對(duì)神經(jīng)元損傷進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。有報(bào)道表明，腦出血患者的臨床預(yù)后與血清NSE含量有直接而明顯的關(guān)系［7］。因此監(jiān)測(cè)NSE水平可以作為判斷腦組織損傷以及預(yù)后的指標(biāo)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“腦為髓之?！薄澳I主骨生髓通腦”“瘀血不去新血不生”“痰瘀同源”。本院山東省名中醫(yī)張樹(shù)泉教授提出：絡(luò)破血溢，痰瘀阻竅，髓海損傷是出血性中風(fēng)的病理核心。腦組織損傷是腎虛的物質(zhì)基礎(chǔ)，血腫及其導(dǎo)致的缺血是血瘀的物質(zhì)基礎(chǔ)，循環(huán)障礙及腦組織水腫是痰阻的物質(zhì)基礎(chǔ)，其基本病機(jī)為腎虛血瘀痰阻。補(bǔ)腎活血化痰是出血性中風(fēng)的基本治法［8］。補(bǔ)腎活血化痰方為治療基本方，具有補(bǔ)腎活血、化痰利水之功。前期臨床觀察治療急性期腦出血患者90例，能明顯促進(jìn)急性期血腫吸收，減輕腦組織水腫，改神經(jīng)功能缺損NIHSS評(píng)分，改善預(yù)后［2］。

本研究顯示，補(bǔ)腎活血化痰方組大鼠各時(shí)間點(diǎn)的腦組織含水量明顯低于模型組，并且MMP-9的表達(dá)水平均較模型組明顯下降，提示補(bǔ)腎活血化痰方抗腦出血后腦水腫的作用強(qiáng)，其機(jī)制可能與抑制MMP-9的表達(dá)從而減輕血腦屏障的破壞有關(guān)。同時(shí)，還觀察了腦出血后對(duì)血清NSE水平的影響，結(jié)果顯示補(bǔ)腎活血化痰方組大鼠48、72、120 h時(shí)的血清NSE水平明顯低于模型組，提示該方能減輕急性期腦出血大鼠的神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而有利于抑制腦水腫的形成，保護(hù)神經(jīng)功能。因此，補(bǔ)腎活血化痰方對(duì)中藥治療腦出血提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但中藥治療腦出血的作用機(jī)制是多方面的，還需要進(jìn)一步探討。

［1］許宏偉，楊期東，劉曉英，等.MMP-2/9與腦出血后腦水腫的關(guān)系探討［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2004，21（4）：295-297.

［2］張樹(shù)泉，徐西元，侯斌，等.補(bǔ)腎活血化痰方治療急性期腦出血臨床研究［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21（4）：529-531.

［3］Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenaseinduced intracerebral hemorrhage in rats［J］.Stroke，1990，21（5）：801-807.

［4］Hua Y，Schallert T，Keep RF，et al.Bahavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Stroke，2002，33：2478-2484.

［5］Rosell A，Cuadrado E，Ortega-Aznar A，et al.MMP-9 positive neutrophil infiltration is associated to blood-brain barrier breakdown and basal lamina typeⅣcollagen degradation during hemorrhagic transformation after human ischemic stroke［J］.Stroke，2008，39（4）：1121-1126.

［6］朱貴忠，楊進(jìn)波.急性腦出血患者血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶含量的變化［J］.西部醫(yī)學(xué)，2010，22（7）：1278-1280.

［7］劉水云，李炳法，楊文東.高血壓腦出血患者血清NSE、MMPO水平變化及其臨床價(jià)值［J］.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與臨床，2012，23（1）：42-44.

［8］張樹(shù)泉，張長(zhǎng)平，陳馬力.論補(bǔ)腎活血化痰是腦出血的重要治法［J］.中國(guó)中醫(yī)急癥，2012，21（3）：367-369.

The Effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 Expression and NSE in Serum in Rats with Intracerebral Hemorrhage

HOU Bin，ZHANG Shuquan，CHEN Zailin.Taian Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong，Taian 271000，China

Objective：To investigate the effect of Bushen Huoxue Huatan Decoction on MMP-9 expressions and NSE in serum in rats with intracerebral hemorrhage.Methods：Intracerebral hemorrhage（ICH）models were made with nonthrombogenic autologous blood injection method，and then the rats were randomly divided into 3 groups：the sham operation group，the model group and the Bushen Huoxue Huatan group.Rats in the sham operation group and the model group were given saline while rats in the Bushen Huoxue Huatan group were intragastrically administrated with Bushen Huoxue Huatan decotion every day.After cerebral hemorrhage 24 h，48 h，72 h and 120 h，cerebral water content was detected，and then brain was turned to detect the expression of MMP-9 with immunohistochemical method which was expressed around hematoma.NSE was detected with ELISA method.Results：Both cerebral water content and MMP-9 levels in Bushen Huoxue Huatan group at all the four time points were lower than those of the model group after ICH（P＜0.05，P＜0.01，respectively）.NSE concentration in serum was distinct lower than the model group at the time point of 48 h，72 h and 120 h after ICH（P＜0.01，respectively）.Conclusion：Bushen Huoxue Huatan Decoction may increase the expression of MMP-9 and reduce NSE concentration to protect the cerebral nerve of cerebral hemorrhage.

Bushen Huoxue Huatan Decoction；Intracerebral hemorrhage；MMP-9；NSE

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1543-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.014

2015-05-09）

山東省泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20103063）