陳　鋰　彭　亮

孕早期HCMV活動性感染實驗室診斷方法的比較和評價

陳鋰彭亮

目的 比較和評價人巨細胞病毒（HCMV）pp65抗原、IgM抗體和DNA三種檢測方法對孕早期HCMV活動性感染的臨床診斷應(yīng)用價值。方法 采集臨床疑似孕早期HCMV活動性感染的孕婦血標本（共200份），分離血漿和白細胞涂片、固定，分別用于HCMV-IgM抗體檢測、熒光定量HCMV DNA檢測和HCMV-pp65抗原檢測，三種方法作平行比較。結(jié)果 pp65抗原檢測的檢出率明顯高于IgM抗體檢測（P＜0.05），與IgM抗體檢測的符合率為85%；與HCMV DNA檢測比較，pp65抗原檢測法的符合率為96%，一致性較好，兩者之間的陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （ P＞ 0.05 ），而且高pp65抗原血癥與患者的臨床癥狀密切相關(guān)。結(jié)論 pp65抗原血癥反映該病毒活動狀況，比目前廣泛采用的血清HCMV-IgM抗體檢測法能更好的監(jiān)測孕早期HCMV活動性感染，提高臨床的診斷率。與熒光定量PCR檢測法比較方法簡便，檢測費用低，并且二者陽性檢出率無明顯差異。

人巨細胞病毒 孕早期 HCMV-pp65抗原 HCMV-IgM抗體 HCMV-DNA

人巨細胞病毒（HCMV）屬β皰疹病毒亞科，具有較嚴格的種屬特異性和潛伏-激活的特性［1］。正常人群對于HCMV普遍易感，在免疫功能正常的情況下多表現(xiàn)為隱性感染或潛伏感染［2］，而妊娠早期由于內(nèi)分泌激素的改變和免疫力的下降易導(dǎo)致病原體的感染或孕婦體內(nèi)潛伏的病毒被激活而產(chǎn)生復(fù)發(fā)感染［3］，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)，通過胎盤垂直傳播引起新生兒畸形、智力低下等，因此早期快速監(jiān)測潛伏病毒是否被激活而采取適當?shù)闹委熤陵P(guān)重要。目前我國主要以血清HCMVIgM抗體陽性和熒光定量PCR檢測HCMV-DNA拷貝數(shù)為實驗室診斷指標。近年來隨著檢驗技術(shù)的進步，HCMV-pp65抗原檢測用于HCMV活動性感染的診斷已逐漸應(yīng)用于臨床［4］。本文比較并評價了這三種方法在孕早期婦女HCMV活動性感染診斷中的應(yīng)用。

1　臨床資料

1.1一般資料 200例標本為本院2011年10月至2014年8月門診產(chǎn)檢疑似HCMV感染的孕早期婦女（妊娠1～12周），年齡22～35歲，平均年齡26.1歲。在知情同意情況下采集外周血5ml（EDTA抗凝），分裝2個試管。標本2h內(nèi)送檢，一管作熒光定量PCR和HCMV-IgM抗體檢測，另一管用右旋糖酐沉降法分離外周血多形核白細胞（PMNLs），用PBS緩沖液調(diào)節(jié)細胞計數(shù) 1.5×106個/ml，制白細胞涂片，每張玻片加樣 100μl（每張玻片約 1.5×105個細胞），用玻片離心機離心，待玻片干燥后，用4%多聚甲醛固定。

1.2檢測方法 （1）抗HCMV-IgM抗體檢測：每份血漿標本均檢測抗HCMV-IgM抗體，采用ELISA法（德國維潤賽潤公司），嚴格按照說明書操作。（2） HCMV-pp65抗原血癥檢測：采用間接熒光免疫染色法（北愛爾蘭IQ公司）檢測孕婦的外周血多形核白細胞HCMV -PP65抗原。結(jié)果判斷：熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。陽性結(jié)果：細胞核或漿發(fā)出明亮的黃綠色熒光為pp65陽性細胞。當陽性細胞數(shù)＞5個/2×105PMNLs時，結(jié)果判為HCMV-pp65抗原陽性。嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。（3）血漿HCMV-DNA檢測：采用中山醫(yī)科大學(xué)達安基因診斷公司HCMV-DNA熒光定量PCR試劑盒。反應(yīng)在美國Roche公司LightCycler全自動熒光定量PCR儀上進行。HCMV-DNA拷貝數(shù)＞5.0×102拷貝/ml為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SAS 9.13 統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1HCMV-pp65抗原與血漿IgM抗體檢測結(jié)果比較 對200份血液標本分別行HCMV-pp65抗原、HCMV-IgM抗體和HCMV-DNA檢測，結(jié)果表明，HCMV-pp65抗原血癥的檢出率明顯高于HCMV-IgM（P＜0.05），二者符合率為85%（170/200）。見表1。

表1　HCMV-pp65抗原與血漿IgM抗體檢測結(jié)果比較［n（%）］

2.2HCMV-pp65抗原與血漿HCMV-DNA檢測結(jié)果比較 HCMV-pp65抗原檢測與熒光定量PCR檢測比較一致率為96%（192/200），陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2　HCMV-pp65抗原與血漿HCMV-DNA檢測結(jié)果比較［n（%）］

3　討論

人是HCMV感染的唯一宿主，其在人群中感染非常普遍，據(jù)報道［5］歐美等發(fā)達國家人群 HCMV 抗體陽性率在50%～80%，我國成人HCMV感染率可達80%～97%，并且多為隱性感染［6］。正常情況下患者無明顯臨床癥狀，當機體免疫功能下降時，病毒激活發(fā)生顯性感染。妊娠期婦女免疫力下降，容易導(dǎo)致病毒激活［3］，尤其是妊娠早期，由于胎盤屏障功能尚不完全，病毒可通過母血經(jīng)胎盤垂直傳播給胎兒，引起胎兒宮內(nèi)的感染，造成胎兒流產(chǎn)、早產(chǎn)、死亡或胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多器官的受損。因此如何準確、快速、特異性地檢測到早期HCMV活動性感染成為臨床治療的關(guān)鍵。病毒分離法一直被認為是診斷HCMV活動性感染可靠性和特異性最強的方法，但由于HCMV在體外生長速度緩慢、檢測時間長、不能快速確診以滿足臨床需要主要應(yīng)用于科研?，F(xiàn)在臨床實驗室主要通過檢測血清HCMV-IgM抗體和熒光定量PCR檢測HCMVDNA拷貝數(shù)。HCMV-IgM抗體可于感染后3～5d首次出現(xiàn)，可持續(xù)3～6個月，則提示近期活動性感染。雖然血清HCMV-IgM抗體檢測常被用作診斷感染性疾病的原發(fā)感染，但是該法特異性高，敏感性差，受制于檢測IgM抗體方法學(xué)的因素多，陽性率低，容易漏診。而熒光定量PCR能檢測病毒載量絕對值，具有重復(fù)性好且敏感性強的特點，但需審批成立PCR實驗室，基層醫(yī)院無法開展此項檢測，不適于人群普查。隨著臨床研究的深入，近年來發(fā)展了檢測血漿HCMV-pp65抗原來診斷早期HCMV活動性感染的技術(shù)。當HCMV活動性感染時，一個顯著的標志是外周血多形核細胞中出現(xiàn)大量的pp65蛋白［4］，其是HCMV復(fù)制早期產(chǎn)生的被膜蛋白最主要的一種，也是活動性HCMV感染時外周血白細胞中的主要抗原，pp65抗原作為一早晚期抗原在感染周期的早晚期均有表達。針對HCMV-pp65的單克隆抗體通過熒光免疫組化技術(shù)檢測外周血多形核細胞中HCMV-pp65抗原。本資料對孕早期疑似HCMV活動性感染的孕婦進行三種方法的檢測和比較，結(jié)果顯示HCMV-pp65抗原血癥的檢出率明顯高于HCMV-IgM抗體 （P＜0.05），二者符合率為85%（170/200）。同時與熒光定量PCR檢測比較較一致率為96%（192/200），陽性檢出率無顯著差異（P＞0.05），且HCMV-pp65抗原陽性細胞數(shù)與HCMV-DNA拷貝數(shù)呈良好相關(guān)性（r=0.86），從而證實了HCMV-pp65抗原檢測在判斷HCMV活動性感染中的有效性。綜上所述，HCMV-pp65抗原檢測為早期診斷HCMV感染的一種優(yōu)選方法，對孕婦妊娠早期HCMV活動性感染進行監(jiān)測及指導(dǎo)治療具有較好的臨床應(yīng)用價值。

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310006 杭州市第一人民醫(yī)院中心實驗室