王　　迪，牟建樓，*，劉春冉，王　　頡，曹寶忠，蘇迎會（.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定07000；.河北保定槐茂有限公司，河北保定0705）

響應面優(yōu)化酶解法制備蝦油工藝研究

王迪1，牟建樓1，*，劉春冉1，王頡1，曹寶忠2，蘇迎會2
（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定071000；2.河北保定槐茂有限公司，河北保定071051）

以剝離蝦仁的蝦殼為主要原料，利用曲霉及其孢子分離后的麩皮殘渣作為酶來源，對其酶解發(fā)酵，以游離氨基酸態(tài)氮含量（FAN）為指標，通過單因素實驗、響應面分析法優(yōu)化酶解法制備蝦油工藝。從而確定最佳工藝條件為：麩皮殘渣添加量6.3 g、蝦殼粉質(zhì)量20.7 g、食鹽濃度15.0%、發(fā)酵溫度46.0℃。結(jié)果表明：該條件下制備的蝦油，游離氨基酸態(tài)氮含量為0.419 g/100 mL，與預測值0.432 g/100 mL相差不大。本文為蝦殼的綜合利用提供了理論依據(jù)及實踐方法。

響應面，酶解，蝦殼，蝦油

蝦類在我國漁業(yè)經(jīng)濟中占有重要地位，我國是世界蝦產(chǎn)品的最大生產(chǎn)國，根據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》（2013年）統(tǒng)計，2012年我國蝦類產(chǎn)量約447.714萬噸，在加工蝦仁的過程中被廢棄的蝦頭、蝦殼等約占整個蝦重的30%～40%［1-2］，而蝦頭蝦殼中含有很多營養(yǎng)物質(zhì)，主要體現(xiàn)為蛋白質(zhì)、游離氨基酸和礦物質(zhì)，同時還有豐富的幾丁質(zhì)、蝦青素以及DHA和EPA［3-10］，廢棄的蝦頭、蝦殼既污染環(huán)境，又浪費資源，我國“十二五”規(guī)劃要求加大水產(chǎn)品和加工副產(chǎn)物的開發(fā)利用力度，提高水產(chǎn)品附加值，因此如果能較好地利用這些廢棄物資源，不僅能保護環(huán)境，還能獲得很大的經(jīng)濟效益。

蝦油不但味道鮮美，而且具有極高的營養(yǎng)價值，蝦油呈現(xiàn)的鮮味主要是其中的呈味氨基酸作用，氨基酸是醬油、蝦油等調(diào)味品鮮味的主要來源，是由制造原料（大豆、小麥、麩皮、蝦等）中的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，是展示此類調(diào)味品質(zhì)量的重要指標。蝦油是我國沿海一帶及日本、東南亞各國人民傳統(tǒng)的調(diào)味品［11］。傳統(tǒng)的蝦油一般是以小蝦、食鹽為原料［12］，在常溫下經(jīng)過數(shù)月乃至數(shù)年自然釀制而成，目前也有用蝦頭、蝦殼等廢棄物酶解發(fā)酵制作蝦油的，但所使用酶多為商品化酶制劑，成本高［13］。因此降低成本、快速酶解制備蝦油也是一個亟待解決的問題。

本文以蝦殼為原料，利用曲霉及其孢子分離后的麩皮殘渣（生產(chǎn)曲精的工廠作為飼料出售）為酶來源，以氨基酸態(tài)氮含量為指標，通過酶解制備蝦油，不但大大降低了蝦油生產(chǎn)成本，而且釀制的蝦油含有豐富的氨基酸和風味物質(zhì)［14］，在節(jié)約資源的同時避免了環(huán)境的污染，同時提高了經(jīng)濟利用價值［15-18］。實驗中應用響應面（RSM）分析法［19］對蝦油的生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，旨在為蝦油工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦殼由滄州黃驊東源水產(chǎn)有限公司提供，-20℃保存；曲霉及其孢子分離后的麩皮殘渣（蛋白酶活力為432U/g）河北保定槐茂有限公司提供；氫氧化鈉、氯化鈉、甲醛、無水乙醇均為分析純。

SPX生化培養(yǎng)箱寧波東南儀器有限公司；Delta320pH計梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DF-101S磁力攪拌器石家莊陽星儀器貿(mào)易有限公司；DKB-600B型電熱恒溫水浴鍋上海益恒實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1酶解蝦殼提取蝦油工藝流程蝦殼→干燥→粉碎→酶解→滅酶→過濾→粗品蝦油

工藝說明：酶液的制備：將曲霉及其孢子分離后的麩皮殘渣（以下簡稱為麩皮殘渣），加蒸餾水于40℃恒溫1 h，然后過濾，得到酶液。

1.2.2單因素實驗

1.2.2.1麩皮殘渣添加量的確定稱取20.0 g干燥蝦殼粉，加入15.0%食鹽。取4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 g麩皮殘渣，活化過濾得酶液，分別加到等質(zhì)量的蝦殼粉中，于45.0℃酶解發(fā)酵40 h，測定氨基酸態(tài)氮含量（FAN值），確定適宜的麩皮殘渣添加量。

1.2.2.2蝦殼粉質(zhì)量的確定稱取6.0 g麩皮殘渣，活化過濾得酶液，取50 mL分別加入到8.0、12.0、16.0、20.0、24.0 g蝦殼粉中，加15.0%食鹽，于45.0℃酶解發(fā)酵40 h，測定FAN值，確定適宜的蝦殼粉質(zhì)量。

1.2.2.3食鹽濃度的確定稱取6.0 g麩皮殘渣，活化過濾得酶液，分別取50 mL加入等質(zhì)量的蝦殼粉中，分別加入11.0%、13.0%、15.0%、17.0%、19.0%的食鹽，于45.0℃酶解發(fā)酵40 h，測定FAN值，確定適宜的食鹽濃度。

1.2.2.4發(fā)酵溫度的確定稱取6.0 g麩皮殘渣，活化過濾得酶液，分別取50 mL加入到等質(zhì)量的蝦殼粉中，添加15.0%食鹽，分別于30.0、35.0、40.0、45.0、50.0℃酶解發(fā)酵40 h，測定FAN值，確定適宜的酶解溫度。

1.2.3響應面實驗在單因素實驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，進行響應面實驗，實驗以隨機次序進行，重復3次，確定酶解法制備蝦油的最優(yōu)工藝，因素水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken中心組合設計因素及水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.2.4游離氨基酸態(tài)氮的測定方法采用GB/T 5009.39-2003的甲醛滴定法［20］。

1.2.5統(tǒng)計分析方法使用SPSS 17.0軟件進行方差分析（ANOVA），鄧肯氏多重域檢驗確定數(shù)據(jù)間的差異，顯著水平為p＜0.05；響應面實驗采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件，進行響應面分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1麩皮殘渣添加量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖1可以看出，其他條件不變的情況下，在一定范圍內(nèi)，隨著麩皮殘渣用量的增加，酶與底物作用的機會逐漸增多，酶的催化效率亦逐漸升高，F(xiàn)AN值則明顯提高（p＜0.05）。但當麩皮殘渣用量超過6.0 g后，隨著用量的增加，F(xiàn)AN值增加緩慢，差異不顯著（p＜0.05），說明在該底物濃度下，酶濃度已經(jīng)趨于飽和，麩皮殘渣用量的增加也會使生產(chǎn)成本增加，因此選擇麩皮殘渣添加量6.0 g為宜。

圖1　麩皮殘渣添加量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量影響Fig.1　Influence of residue of bran on shrimp sauce FAN content

2.1.2蝦殼粉質(zhì)量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量的影響

由圖2可以看出，其他條件不變的情況下，在一定量的范圍內(nèi)，隨著蝦殼粉質(zhì)量的增加，F(xiàn)AN值則明顯提高，蝦殼粉質(zhì)量超過20.0 g時，F(xiàn)AN值開始減?。╬＜0.05）。從最大程度提高FAN值及節(jié)省原料的角度考慮，選擇蝦殼粉添加量為20.0 g較為合適。

圖2　蝦殼粉質(zhì)量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量影響Fig.2　Influence of shrimp shells on shrimp sauce FAN content

2.1.3食鹽添加量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖3可知，其他條件不變的情況下，F(xiàn)AN值隨著加鹽量的呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（p＜0.05），因為食鹽會抑制微生物的增長，從而在一定程度上減少了氨基酸態(tài)氮的分解；然而當食鹽濃度大于15.0%以后，麩皮殘渣中的酶活性受到抑制，氨基酸態(tài)氮含量不再增加，食鹽濃度越大，抑制效果越明顯，蛋白質(zhì)分解也就越不完全，F(xiàn)AN值會越低。食鹽的添加不僅能抑制微生物的生長繁殖，還能賦予產(chǎn)品新的風味，實驗選擇適宜的食鹽添加量為15.0%。

圖3　食鹽濃度對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量影響Fig.3　Influence of salt concentration on shrimp sauce FAN content

2.1.4發(fā)酵溫度對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量的影響由圖4可知，其他條件不變時，在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，F(xiàn)AN值隨之增加（p＜0.05），50.0℃時，中性蛋白酶發(fā)揮最大活性和穩(wěn)定性，但是，此溫度下半成品蝦油品質(zhì)下降，有異味，而在45.0℃時，蛋白酶基本能夠最大程度地使蛋白質(zhì)水解，此溫度時FAN值達到較大；而溫度過高又會導致酶失活而失去催化能力，實驗確定適宜發(fā)酵溫度為45.0℃。

圖4　發(fā)酵溫度對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量影響Fig.4　Influence of fermentation temperature on shrimp sauce FAN content

2.2響應面實驗

2.2.1響應面實驗設計及結(jié)果不同的實驗條件下，蝦油中氨基酸態(tài)氮含量結(jié)果見表2，回歸模型顯著性檢驗結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，所建立的回歸模型的p值小于0.0001，由此說明，所建立的模型對本實驗擬合性良好（p＜0.0001）。該結(jié)果同時表明，所建立回歸模型中實驗值與理論值接近。此外，較小的變異系數(shù)（CV）（6.495）說明實驗具有較高的精密度。利用Design Expert 8.05對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得擬合二次多項式方程為：

Y=-7.4845+0.1278A+0.0939B+0.3120C+0.1843D+ 0.0007AB+0.0074AC+0.0008AD+0.0038BC+0.0002BD-0.0013CD-0.0229A2-0.0039B2-0.0128C2-0.0019D2

從表3中的p值來看，四個因素對響應值的影響均顯著，由此可見，各具體實驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關(guān)系。且因素AC之間，BC之間有交互作用，即麩皮殘渣添加量與食鹽濃度之間，蝦殼粉質(zhì)量與食鹽濃度之間均有交互作用。從F值來看，F(xiàn)A＞FB＞FC＞FD表明四個因素對響應值影響程度的大小，即與食鹽濃度以及發(fā)酵溫度相比，麩皮殘渣添加量以及蝦殼粉質(zhì)量對蝦油中氨基酸態(tài)氮含量的影響更大［21］。

表2　響應曲面法優(yōu)化實驗設計及結(jié)果Table 2　Experimental design and results of response surface methodology

2.2.2響應面分析與交互作用根據(jù)回歸模型繪制相應的響應曲面圖，其中有交互作用的兩因素相應的響應面圖見圖5。

由圖5（a）可見，在一定范圍內(nèi)，蝦油的FAN值隨著麩皮殘渣添加量的增加而增加，是因為麩皮殘渣中的酶類能夠促進蝦殼中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為氨基酸；但是當麩皮殘渣過量以后，由于底物蝦殼是一定的，可能有一部分氨基酸態(tài)氮被麩皮殘渣中的酶類或菌所分解，因此FAN值會下降［22］，因此過量的麩皮殘渣也會影響蝦油中氨基酸態(tài)氮的含量。

表3　回歸模型顯著性檢驗結(jié)果Table 3　Significance test for regression model

圖5　各因素交互影響FAN值的響應面圖Fig.5　Response surface plot showing the interactive influence on the yield of FAN

由圖5（b）可見，不同量的蝦殼粉（16.0～24.0 g）對蝦油FAN值的影響，在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)AN值隨著蝦殼粉添加量的增加而增加，主要是因為在一定范圍內(nèi)隨著蝦殼粉的增加，麩皮殘渣中的酶類分解蝦殼粉中蛋白質(zhì)，氨基酸態(tài)氮含量增加，并且在蝦殼粉為20.0 g左右時氨基酸態(tài)氮達到最大值；當蝦殼粉繼續(xù)增加時，氨基酸態(tài)氮含量開始下降，可能是因為蝦殼分解不完全所致［23］。

而兩圖中當食鹽濃度為15.0%左右時，氨基酸態(tài)氮含量達到最大值，此后隨著食鹽濃度的增加，氨基酸態(tài)氮含量開始減少，主要是因為適量的食鹽能抑制一些雜菌的生長，從而抑制雜菌分解氨基酸態(tài)氮［24］，當食鹽濃度過高以后，會抑制麩皮殘渣中酶類的活性，阻止了其分解蝦殼中的蛋白質(zhì)，導致氨基酸態(tài)氮含量減少。

2.2.3實驗條件的優(yōu)化及驗證根據(jù)Box-Behnken中心組合設計實驗結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.05軟件分析，得到酶法制備蝦油的最佳工藝條件為麩皮殘渣添加量6.29 g、蝦殼粉質(zhì)量為20.67 g、食鹽濃度為14.82%，發(fā)酵溫度為45.93℃，在此條件下FAN值的理論最大值為0.432 g/100 mL，結(jié)合實際情況及可操作性，確定麩皮殘渣添加量6.3 g，蝦殼粉質(zhì)量20.7 g，食鹽濃度15.0%，發(fā)酵溫度46.0℃，為檢驗響應面模型預測的可靠性，采用上述優(yōu)化后的酶解工藝條件進行驗證實驗，重復3次，測得FAN值平均為0.419 g/100 mL，與模型預測值的比較誤差為3.03%，說明運用響應面優(yōu)化得到的模型參數(shù)可靠。

3　結(jié)論

應用響應面法優(yōu)化了從蝦殼中提取蝦油的工藝，結(jié)果表明，各因素對蝦油中氨基酸態(tài)氮的含量都有顯著性的影響，并且運用響應面法建立了蝦殼制取蝦油的二次回歸模型；采用此模型得到酶法制備蝦油的最佳工藝條件為麩皮殘渣添加量6.3 g、蝦殼粉質(zhì)量為20.7 g、食鹽濃度為15.0%，酶解溫度為46.0℃，在此條件下氨基酸態(tài)氮含量為0.419 g/100 mL。為蝦殼的再利用提供了理論數(shù)據(jù)與科學依據(jù)。

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Optimizing enzymatic production of shrimp sauce by response surface methodology

WANG Di1，MU Jian-lou1，*，Liu Chun-ran1，WANG Jie1，CAO Bao-zhong2，SU Ying-hui2
（1.College of Food Science and Technical，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，China）2.Huaimao Limited Company of Baoding，Baoding 071051，China）

The shrimp sauce was made from shrimp shells by enzymatic hydrolysis of residue of bran separated aspergillus and spores.Free amino nitrogen（FAN）was taken as indexes to single factor experiment and optimizing enzymatic production of shrimp sauce by response surface methodology.The optimal process conditions were as follows：6.3 g residue of bran，20.7 g shrimp shells，15.0%salt concentration and 46.0℃fermentation temperature.FAN of Shrimp sauce made under such condition contains was 0.419 g/100 mL-nearly the same as the forecast value 0.432 g/100 mL.It could be regarded as the theory basis and practice method.

response surface methodology；enzymatic hydrolysis；shrimp shells；shrimp sauce

TS254.9

B

1002-0306（2015）18-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.042

2014－11－13

王迪（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail：wd880508@163.com。

牟建樓（1973-），女，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏，E-mail：jianloumu2005@sina.cn。

國家海洋公益性行業(yè)科研專項（201205031）。