朱小紅 張熔熔

·論著·

D2-40/S100、CD34/S100檢測(cè)在皮膚惡性黑素瘤脈管轉(zhuǎn)移診斷中的應(yīng)用

朱小紅 張熔熔

目的 探討皮膚惡性黑素瘤（CMM）脈管微轉(zhuǎn)移的免疫組化檢測(cè)方法及臨床意義。方法 經(jīng)組織病理檢查證實(shí)的CMM患者53例，男32例，女21例。年齡52～72（61.2±8.4）歲。每例取腫瘤中心部位的瘤組織，部分病例包括清掃淋巴結(jié)標(biāo)本。平均隨訪時(shí)間（65.00±5.68）個(gè)月。隨訪期間17例患者死于CMM復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，6例失訪。采用組合式單克隆抗體和雙酶標(biāo)記的免疫組化雞尾酒法檢測(cè)53例CMM標(biāo)本，在同一張組織切片上檢測(cè)D2-40、S100、CD34抗原的表達(dá)情況。結(jié)果 53例CMM患者，HE染色+組合式單克隆抗體陽(yáng)性16例（30.19%），雙酶標(biāo)記的免疫組化雞尾酒法陽(yáng)性26例（49.06%），兩種方法的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.94，P＜0.05）。血管淋巴管瘤栓組26例中21例（80.77%）、無(wú)瘤栓組27例中10例（37.04%）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=10.43，P＜0.001）；血管淋巴管瘤栓組與同期無(wú)血管淋巴管瘤栓組5年生存率分別為42.31%（11/26）與70.37%（19/27）（χ2=4.25，P＜0.05）。結(jié)論 免疫組化雞尾酒法檢測(cè)在診斷血管和淋巴管瘤栓上優(yōu)于HE+組合式單克隆抗體檢查，血管和淋巴瘤栓是CMM患者的重要預(yù)后因素。

黑色素瘤；淋巴轉(zhuǎn)移；S100蛋白質(zhì)類；抗原，CD34；D2-40；免疫組化雞尾酒法

隨著皮膚惡性黑素瘤（CMM）臨床病理研究的不斷深入，微小轉(zhuǎn)移灶（亞臨床病灶）的治療日益受到重視。本文用組合式單克隆抗體和雙酶標(biāo)記的免疫組化雞尾酒法檢測(cè)CMM標(biāo)本特異性淋巴管標(biāo)記物（D2-40）、S100蛋白、CD34內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記（CD34）抗原的表達(dá)情況，分析了淋巴管/血管瘤栓與CMM治療及預(yù)后的相關(guān)性，并比較了上述二種方法對(duì)CMM腫瘤中及其腫瘤周圍淋巴管、血管瘤栓檢出率以及檢出率高低與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

資料與方法

一、病例資料

研究對(duì)象為2005年1-12月無(wú)錫市第二人民醫(yī)院普外科及皮膚科行CMM手術(shù)切除的病例，共53例，其中男32例，女21例。年齡52～72（61.2±8.4）歲。每例取腫瘤中心部位的瘤組織，部分病例包括清掃淋巴結(jié)標(biāo)本。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)。隨訪期末為2010年12月31日，平均隨訪時(shí)間（65.00±5.68）個(gè)月。隨訪期間17例患者死于CMM復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，6例失訪。17例死亡患者最短生存時(shí)間為7個(gè)月，最長(zhǎng)生存時(shí)間70個(gè)月。

二、染色方法

將所有石蠟標(biāo)本連續(xù)4 μm切片6張。3張采用組合式單克隆抗體和2張采用雙酶標(biāo)記的免疫組化雞尾酒法檢測(cè)D2-40、S100、CD34抗原的表達(dá)情況，1張行HE染色。試劑均為福建邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，有單染試劑盒和雙染試劑盒，染色方法為SP法。全部標(biāo)本均用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對(duì)照，采用該公司提供的已知CMM組織切片作陽(yáng)性對(duì)照，操作步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

三、結(jié)果判斷

D2-40陽(yáng)性染色位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒；免疫組化雞尾酒法D2-40為黑色。CD34陽(yáng)性染色位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒；免疫組化雞尾酒法CD34為黑色；血管、淋巴管為由內(nèi)皮細(xì)胞形成的條狀、裂隙狀、管狀等孤立或簇狀結(jié)構(gòu)。S100陽(yáng)性表達(dá)為腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)或胞核被染成棕黃色；免疫組化雞尾酒法S100為紅色。CMM組織D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒染色顯示，D2-40、CD34陽(yáng)性物質(zhì)分別定位于淋巴管、血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)，腫瘤細(xì)胞表達(dá)S100，在部分D2-40、CD34陽(yáng)性的淋巴管、血管內(nèi)觀察到S100陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞團(tuán)，作為判斷淋巴管、血管內(nèi)瘤栓的依據(jù)。

HE染色明確血管或淋巴管，結(jié)合單克隆抗體免疫組化染色該血管或淋巴管內(nèi)確實(shí)為S100陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞；或HE染色明確腔內(nèi)為腫瘤細(xì)胞，結(jié)合單克隆抗體免疫組化染色證實(shí)該腫瘤細(xì)胞位于CD34陽(yáng)性的血管或D2-40陽(yáng)性的淋巴管內(nèi)，則認(rèn)為該血管或淋巴管內(nèi)有瘤栓。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析處理。兩組間的比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

53例CMM患者中，HE染色+單克隆抗體免疫組化陽(yáng)性16例（30.19%），雙酶標(biāo)記的免疫組化雞尾酒法陽(yáng)性26例（49.06%），兩種方法的陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.94，P＜0.05）。27例無(wú)血管淋巴管瘤栓的患者中有10例（37.04%）已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而26例有血管淋巴管瘤栓的患者中21例（80.77%）有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管淋巴管瘤栓組淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著高于無(wú)瘤栓組（χ2=10.43，P＜0.001）。見(jiàn)表1。

26例有血管淋巴管瘤栓患者中，血管內(nèi)瘤栓3例，5年后無(wú)1例生存；淋巴管內(nèi)瘤栓18例，5年后11例生存；血管及淋巴管內(nèi)均有瘤栓5例，5年后無(wú)1例生存。血管瘤栓患者的5年生存率為0，淋巴管瘤栓患者為66.11%。

血管淋巴管瘤栓組26例5年生存率為42.31%（11/26），無(wú)血管淋巴管瘤栓組27例為70.37%（19/27），兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.25，P ＜ 0.05）。見(jiàn)表1。

討 論

文獻(xiàn)報(bào)道［1］，CMM的預(yù)后除了與腫瘤的厚度、部位、組織學(xué)類型、患者性別以及有無(wú)潰瘍有密切關(guān)聯(lián)以外，血管和淋巴管浸潤(rùn)也是CMM患者預(yù)后的重要因素，血管浸潤(rùn)與患者的生存率顯著相關(guān)。由于血管、淋巴管內(nèi)腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少且無(wú)任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)的影像學(xué)、病理學(xué)檢查難以發(fā)現(xiàn)，因此，應(yīng)用免疫組化染色區(qū)分血管瘤栓和淋巴管瘤栓具有非常重要的臨床價(jià)值。單純的HE染色對(duì)區(qū)分淋巴管和小毛細(xì)血管帶有主觀性，并受主檢醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的限制，較難鑒別血管、淋巴管或組織間隙（圖1）。血管和淋巴管相同起源，很多標(biāo)記物在血管、淋巴管均有表達(dá)，長(zhǎng)期以來(lái)一直缺乏特異性的免疫標(biāo)記物區(qū)別二者。D2-40是新近發(fā)現(xiàn)的特異性淋巴管標(biāo)記物［2］，它能特異性地與一種唾液酸糖蛋白M2A結(jié)合，而M2A僅表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮而不表達(dá)于血管內(nèi)皮［3］。CD34是泛血管內(nèi)皮標(biāo)記物之一，應(yīng)用廣泛，認(rèn)為是重復(fù)性好、穩(wěn)定性高、較成熟及相對(duì)特異和敏感的血管內(nèi)皮標(biāo)記物。S100是廣譜S100，其敏感性比HMB-45大，染色強(qiáng)，在CMM的診斷中實(shí)用性較大，比較適用于檢測(cè)常規(guī)病理檢查難以發(fā)現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移［4］。

表1 皮膚惡性黑素瘤組織血管淋巴管瘤栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存率的關(guān)系

圖1 皮膚惡性黑素瘤組織HE染色觀察（HE×200） 1A、1B：明確為脈管組織，但不能確定其內(nèi)的細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞；1C、1D：明確為腫瘤組織，但不確定其周圍為脈管

免疫組化雙染法觀察不同的抗原成分，步驟繁復(fù)，耗時(shí)長(zhǎng)，需要2次標(biāo)記，而且反復(fù)在一張切片上進(jìn)行操作容易引起脫片，結(jié)果也欠穩(wěn)定。單染已顯示為血管或淋巴管，不能同時(shí)確定腔內(nèi)細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞；已顯示腔內(nèi)為腫瘤細(xì)胞，不能同時(shí)確定腔隙為組織間隙還是脈管（圖2）。雞尾酒標(biāo)記染色法是針對(duì)同一靶組織的不同靶抗原，同步觀察幾種抗原在病變組織中的不同表達(dá)情況，較傳統(tǒng)雙染方法縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，并有效避免了內(nèi)源性生物素的干擾，克服了切片間各種差異引起的時(shí)間、空間的樣本誤差，采用抗體組合搭配，結(jié)果穩(wěn)定，且縮減了操作步驟［5］。雞尾酒雙染法可以同時(shí)標(biāo)記血管上皮及腫瘤細(xì)胞，如果鏡下排除制片因素造成的假象，則可以明確為血管或淋巴管的轉(zhuǎn)移。本研究設(shè)計(jì)的D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒雙染法只需在一張切片上同時(shí)加2種抗體，一次就能同步標(biāo)記D-40/S100、CD34/S100各二種抗體，讓我們清晰地看到了血管及淋巴管內(nèi)的腫瘤細(xì)胞（圖3），從而能夠及時(shí)簡(jiǎn)便地給臨床提供診斷。

CMM的轉(zhuǎn)移途徑主要是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CMM淋巴結(jié)內(nèi)轉(zhuǎn)移與否是判斷CMM生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)之一，并直接影響腫瘤臨床分期的準(zhǔn)確性，對(duì)預(yù)測(cè)預(yù)后及術(shù)后綜合治療具有重要的指導(dǎo)意義［6］。因此是腫瘤根治術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要原因之一［7］，是為廣大學(xué)者所公認(rèn)的對(duì)CMM的惡性度判斷最有意義的標(biāo)準(zhǔn)。

腫瘤的淋巴管浸潤(rùn)是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前提，常規(guī)診斷很困難。本實(shí)驗(yàn)中，在CMM中心區(qū)、周邊區(qū)均可見(jiàn)D2-40染色陽(yáng)性的淋巴管分布（圖2A）。如果淋巴管中查見(jiàn)S100染色陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，表明這些淋巴管內(nèi)已有瘤栓形成，腫瘤侵犯血管。提示CMM淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能主要是通過(guò)瘤組織邊緣區(qū)淋巴管引起的。D2-40/S100抗體雞尾酒法在一張切片上清楚地觀察到腫瘤細(xì)胞S100蛋白的表達(dá)情況（圖3A、3B）、腫瘤微淋巴管密度以及淋巴管侵犯的情況，提供的結(jié)果信息量大，標(biāo)記結(jié)果易于判斷，可更直觀清晰地辨別腫瘤細(xì)胞和淋巴管的關(guān)系，易于檢出被腫瘤侵犯的微淋巴管。同樣，CD34/S100抗體雞尾酒法在一張切片上清楚地觀察到腫瘤細(xì)胞S100蛋白在血管內(nèi)的表達(dá)情況（圖3C、3D），說(shuō)明腫瘤侵犯血管。雞尾酒標(biāo)記染色法的陽(yáng)性檢出率明顯高于HE染色組合單克隆抗體染色法，該方法的建立對(duì)于進(jìn)一步探討CMM血管淋巴管轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)、評(píng)估患者的預(yù)后，指導(dǎo)臨床術(shù)后治療均有幫助。

圖2 皮膚惡性黑素瘤組織免疫組化單染法觀察（免疫組化SP法×200） 2A：D2-40顯示淋巴管陽(yáng)性，不能明確其內(nèi)細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞；2B：CD34顯示血管陽(yáng)性，不能確定其內(nèi)細(xì)胞是否為腫瘤細(xì)胞；2C、2D：S100顯示腫瘤組織陽(yáng)性，不能確定其是否在脈管內(nèi)

圖3 皮膚惡性黑素瘤組織D2-40/S100、CD34/S100雞尾酒染色觀察（雞尾酒雙染SP法×200） 3A、3B：D2-40顯示淋巴管陽(yáng)性，S100顯示腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性；3C、3D：CD34顯示血管陽(yáng)性，S100顯示腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性

本試驗(yàn)中我們觀察到，檢測(cè)出血管淋巴管瘤栓的26例患者中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為21例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者明顯高于無(wú)血管淋巴管瘤栓的患者。26例血管淋巴管瘤栓患者中8例累及血管的患者5年后無(wú)1例生存，提示腫瘤周圍血管淋巴管瘤栓對(duì)惡性黑素瘤患者的預(yù)后有一定的影響［8］，它的存在提示外科治療中淋巴結(jié)清掃的重要意義，淋巴管內(nèi)見(jiàn)到瘤栓，其臨床意義等同于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管內(nèi)查見(jiàn)瘤栓是CMM預(yù)后差的指標(biāo)之一。

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2015年英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎(jiǎng)?wù)魑耐ㄖ?/p>

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，其患病率呈上升趨勢(shì)，估計(jì)中國(guó)至少有600萬(wàn)銀屑病患者。隨著科學(xué)的進(jìn)步和對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)，生物制劑已經(jīng)成為治療銀屑病的新選擇。為了促進(jìn)皮膚科醫(yī)師對(duì)生物制劑的認(rèn)識(shí)和交流，西安楊森制藥有限公司與中華皮膚科雜志編輯部聯(lián)合舉辦英夫利西單抗（類克?）臨床應(yīng)用有獎(jiǎng)?wù)魑幕顒?dòng)。2014年征文收到數(shù)十篇高質(zhì)量的文章，將擇優(yōu)刊登在中華皮膚科雜志上。本次征文活動(dòng)得到皮膚科醫(yī)師的歡迎，因此，從2015年繼續(xù)進(jìn)行有獎(jiǎng)?wù)魑幕顒?dòng)，旨在與皮膚科醫(yī)生攜手，交流生物制劑治療銀屑病的經(jīng)驗(yàn)，共同促進(jìn)銀屑病治療的發(fā)展。

一、征文范圍：英夫利西單抗治療重度斑塊型銀屑病的圖片和內(nèi)容展示。

二、征文要求：①未在公開(kāi)出版的雜志上發(fā)表，未在全國(guó)性學(xué)術(shù)會(huì)議上交流；②應(yīng)征論文寫(xiě)作格式請(qǐng)參考中華皮膚科雜志稿約要求；③至少提供患者3組照片，治療前、2周、6周的照片；④請(qǐng)注明第一作者姓名、單位、職稱、地址、郵編、電子郵箱以及聯(lián)系電話；⑤只接受電子郵箱投稿（Word排版），征文電子版發(fā)至郵箱beauty_life2014@163.com，并注明“美麗人生征文”字樣。所有征文恕不退稿，請(qǐng)自留底稿。征文截稿時(shí)間：2015年9月30日。

三、評(píng)選方法和獎(jiǎng)項(xiàng)設(shè)置：由知名專家及相關(guān)專業(yè)專家組成評(píng)審委員會(huì)，對(duì)征文稿件進(jìn)行評(píng)審。獎(jiǎng)項(xiàng)設(shè)置：獲前10名文章作者，資助第一作者參加2016年中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)；其余參與投稿第一作者，均贈(zèng)閱中華皮膚科雜志2016年全年雜志。

2015年全國(guó)皮膚外科、抗衰老及美容學(xué)習(xí)班通知

為提高皮膚美容及皮膚老化治療水平，由中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)整形美容協(xié)會(huì)抗衰老分會(huì)主辦，重慶市中醫(yī)院暨重慶市第一人民醫(yī)院承辦的全國(guó)皮膚外科、抗衰老及美容學(xué)習(xí)班，定于2015年5月15-17日在重慶市舉辦。屆時(shí)將邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)知名專家趙啟明、刁慶春、方方等教授就皮膚美容外科的基礎(chǔ)及臨床進(jìn)行系統(tǒng)講座。學(xué)習(xí)內(nèi)容涉及皮膚腫瘤、瘢痕與瘢痕疙瘩、皮膚老化、注射微美容、激光、光動(dòng)力技術(shù)的應(yīng)用等。學(xué)習(xí)結(jié)束經(jīng)考核合格后，頒發(fā)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)、中國(guó)整形美容協(xié)會(huì)抗衰老分會(huì)皮膚外科、抗衰老及美容學(xué)習(xí)班結(jié)業(yè)證書(shū)，并授予國(guó)家級(jí)Ⅰ類繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育學(xué)分。學(xué)習(xí)班聯(lián)系人：蒲楊 13996088144，Email：1354468542@qq.com，汪蓉 13883103189，Email：gyz917@126.com。

Application of D2-40/S100 and CD34/S100 detection in the diagnosis of blood and lymphatic vessel invasion of cutaneous malignant melanoma

Zhu Xiaohong,Zhang Rongrong.Department of Dermatology,Wuxi No.2 People′s Hospital,Wuxi 214002,Jiangsu,China

Zhang Rongrong,Email:852718606@qq.com

ObjectiveTo develop an immunohistochemical assay for the diagnosis of cutaneous malignant melanoma（CMM）micrometastasis via blood and lymphatic vessels,and to evaluate its clinical significance.MethodsFifty-three patients （32 males and 21 females）histopathologically diagnosed as CMM were enrolled in this study.The patients were aged （61.2±8.4）years（range,52－72 years）.Tissue specimens were obtained from the central area of tumor in each case,and also from removed lymph nodes in some cases.The average duration of follow-up was（65.00±5.68）months.During the follow-up,17 patients died of the recurrence or metastasis of CMM,and 6 patients were lost to follow-up.The expressions of D2-40,S100 and CD34 antigens in 53 tissue specimens were examined by immunohistochemical staining with three individual monoclonal antibodies,or by an immunohistochemical method using 2 two-antibody cocktails （D2-40/S100 and CD34/S100）and double-color chromogens in single tissue sections.ResultsOf the 53 patients,30.19% （16/53） were positive for hematoxylin-eosin （HE） staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies,and 49.06%（26/53）for the immunohistochemical method using two-antibody cocktails and double-color chromogens.Statistical differences were found in the positive rate between the two methods（χ2=3.94,P＜0.05）.Compared with patients without blood/lymph vessel tumor emboli,those with blood/lymph vessel tumor emboli showed higher lymph node metastasis rate（80.77%（21/26）vs.37.04%（10/27）,χ2=10.43,P ＜ 0.001）,but lower five-year survival rate （42.31% （11/26）vs.70.37% （19/27）,χ2=4.25,P ＜ 0.05）.ConclusionsThe immunohistochemical method with two-antibody cocktails is superior to HE staining combined with immunohistochemical staining with individual monoclonal antibodies in the detection of blood/lymph vessel tumor emboli.And blood/lymph vessel tumor emboli may be an important prognostic factor in patients with CMM.

Melanoma;Lymphatic metastasis;S100 proteins;Antigens,CD34;D2-40;Immunohistochemical method with antibody cocktails

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.04.012

214002江蘇，無(wú)錫市第二人民醫(yī)院皮膚科

張熔熔，Email：852718606@qq.com

2014-09-01）

（本文編輯：顏艷）