江勇 楊麗娜 劉原君 侯淑萍 齊蔓莉 劉全忠

沙眼衣原體臨床株對利福平的體外敏感性及rpoB基因耐藥突變檢測

江勇 楊麗娜 劉原君 侯淑萍 齊蔓莉 劉全忠

目的 檢測沙眼衣原體臨床株對利福平的體外敏感性，探討rpoB基因突變與臨床耐藥的關系。方法 采用微量細胞培養(yǎng)法確定利福平對52株沙眼衣原體臨床株的最低抑菌濃度。擴增所有臨床株以及標準株rpoB基因，然后進行單鏈構象多態(tài)性分析。并隨機選取兩株臨床株進行測序。結果 52株臨床菌株中未檢出耐藥株，利福平的最低抑菌濃度是0.004～0.030 mg/L。SSCP和測序均未發(fā)現rpoB耐藥突變。結論 利福平治療沙眼衣原體失敗患者未檢測到rpoB基因突變，利福平治療失敗與多種因素有關。

沙眼衣原體；利福平；微生物敏感性試驗；抗藥性，微生物；DNA突變分析；基因，rpoB

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染治療失敗與耐藥的報告日漸增多［1］。有學者認為對利福平耐藥的產生主要與rpoB基因的點突變有關［2］。為監(jiān)測近年天津市Ct對利福平的體外敏感性，我們檢測52例Ct臨床分離株的體外敏感性，采用單鏈構象多態(tài)性分析（SSCP）方法研究rpoB突變。

一、資料和方法

1.資料：2005年4月至2008年3月，52株Ct臨床株分離自天津市性傳播疾病研究所門診收集的沙眼衣原體尿道炎或宮頸炎患者尿道或宮頸口分泌物，其中36例患者用利福平治療失敗，16例患者未接受利福平治療。采樣標準：直接免疫熒光檢測到衣原體原體或乳膠免疫層析法檢測到目的條帶。男性有不同程度的尿道炎癥狀，女性有陰道異常分泌物；非妊娠期婦女；拭子標本淋球菌、支原體檢測陰性；涂片在油鏡下平均每視野中多形核白細胞數＞5個；就診前2周內未用抗菌藥物。

McCoy細胞來自中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所。利福平標準品來自中國藥品生物制品檢定所。

2.沙眼衣原體細胞培養(yǎng)：參照以往改進的方法分離沙眼衣原體［3］。

3.體外藥物敏感性測定：預先確定能引起90%以上細胞感染的Ct接種量?？咕幑ぷ鳚舛葏⒄瘴墨I［3］，設6個倍比稀釋濃度：0.03、0.015、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/L。將McCoy細胞接種于96孔板孵育24 h，形成致密單層細胞。按接種量加入Ct，32℃，1 100×g，離心1 h后置于5%C02，37℃溫箱中孵育2 h。棄液,每孔加入含不同濃度抗菌藥的感染液（含胎牛血清、慶大霉素、萬古霉素、兩性霉素B、放線菌酮的MEM液）［3］，同時設陰性對照（加藥，不接種沙眼衣原體）和陽性對照（接種沙眼衣原體，不加藥）。孵育48 h，甲醇固定后碘染色，顯微鏡下觀察未見Ct包涵體的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

4.rpoB基因單鏈構象多態(tài)性分析及測序：蛋白酶K法制備基因組DNA。上游引物：5′-GCGAATGGGCGATGAGAAG A-3′，下游引物5′-CCGTACTTGTGTCGGCTTCA-3′［1］。95℃預變性10 min；95℃變性40 s；52℃退火40 s；72℃延伸60 s；35個循環(huán)后，72℃延伸10 min。預期目的片段656 bp。取6 μl PCR產物，加入6 μl普通10X上樣緩沖液，混勻。95℃水浴中變性10 min，取出標本立即冰浴，并置于-20℃5 min。8%聚丙烯酰胺凝膠電泳，4℃，80 V電泳6 h，溴化乙錠染色，紫外線透射反射分析儀下觀察、拍照，電泳較慢的為突變株。同時隨機選擇2株（MIC分別是0.03和0.008 mg/L）PCR產物送上海英駿生物技術有限公司測序。

二、結果

1.藥敏試驗：臨床分離株52株傳代至感染率＞90%，進行利福平體外藥敏試驗，結果MIC值0.004～0.030 mg/L，其中2株、9株、25株、16株MIC值分別是0.004、0.008、0.015、0.030 mg/L。所有MIC值均低于血藥濃度或組織藥物濃度。

2.rpoB基因突變分析：完成52例臨床株及E型標準株rpoB擴增，目的片段656 bp。SSCP檢測未發(fā)現突變株。見圖1，2。測序結果顯示，與E型標準株比較，2株臨床株rpoB基因273位無C→T突變（Ala522→Val），284位也無C→T突變（His526→Tyr）。

圖1 rpoB基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖 1：陰性對照；2～4：臨床株，擴增產物656 bp；5：E型標準株；M：標準參照物

圖2 rpoB單鏈構象多態(tài)性分析聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 E：E型標準株；1～3：不同臨床株。各臨床株與E型標準株電泳后的2條單鏈均在同一水平，表明基因序列相同

三、討論

利福平為利福霉素類半合成廣譜抗菌藥，對多種病原體均有抗菌活性，對宿主細胞內外的病原體均有明顯的殺菌作用。因為不良反應，利福平在臨床中不作為治療非淋病尿道炎的一線藥物。利福平的峰值血藥濃度為7～9 mg/L，遠大于我們測定的MIC值（0.004～0.030 mg/L），顯示了較高的抗衣原體活性。但是，41例樣本（78.85%）測定值高于文獻報道值0.007 5 mg/L［4］。利福平與其他抗生素聯合也有不錯的效果。研究表明，單純阿奇霉素不能將沙眼衣原體從宿主細胞中清除，從而形成持續(xù)感染，可以檢測到Ct的脂多糖和rRNA。但阿奇霉素與利福平聯合時無耐藥，且較早抑制rRNA的合成［4］。

利福平通過與衣原體的RNA聚合酶（RNAP）的β亞單位rpoB結合發(fā)揮作用。rpoB基因核心區(qū)的核苷酸改變引起結合力下降。rpoB主要有3個部位的基因簇Ⅰ～Ⅲ易發(fā)生核苷酸變化，對應的氨基酸位置分別是507-533，560-572，687。其中90%的核苷酸改變位于基因簇Ⅰ?；虼丌竦暮塑账岣淖兣c耐藥有關。2003年，Dreses-Werringloer等［2］檢測5株利福平耐藥突變株的rpoB的核苷酸序列。其中，3株變異株（最小抑菌濃度4 mg/L）在基因簇Ⅰ區(qū)522位密碼子GCA突變成GTA，相應的丙氨酸被纈氨酸所取代；另外2株高水平耐藥的變異株（最小抑菌濃度64～256 mg/L）在基因簇Ⅰ區(qū)526位密碼子CAC突變成TAC，相應的組氨酸被酪氨酸所取代。作者推測還有其他耐藥機制，因為發(fā)生His526→Tyr突變的不同沙眼衣原體株，利福平MIC值可相差4倍。Kutlin等［5］研究2株利福平耐藥沙眼衣原體的rpoB基因，測序發(fā)現其中1株發(fā)生His526→Tyr突變，然而另1株無突變，因此首次提出沙眼衣原體耐受利福平與rpoB基因突變無關。我們采用U.Dreses-Werringloer等的方法，擴增rpoB中心區(qū)的基因簇Ⅰ、Ⅱ，然后通過SSCP檢測rpoB基因突變株。SSCP方法及測序結果均未發(fā)現突變，與藥敏試驗無耐藥株一致。

因此，不良反應較少的利福霉素類藥物，既能殺滅細胞外的衣原體，又能避免衣原體持續(xù)感染，可能將成為治療衣原體感染的理想選擇。利福平可以作為臨床二線用藥治療沙眼衣原體感染，雖然MIC值有所提高，但是遠遠沒有達到體外耐藥的水平。臨床利福平治療沙眼衣原體失敗患者未檢測到rpoB基因突變，利福平治療失敗與多種因素有關。

［1］Mpiga P,Ravaoarinoro M.Chlamydia trachomatispersistence:an update［J］.Microbiol Res,2006,161（1）:9-19.

［2］Dreses-Werringloer U,Padubrin I,K?hler L,et al.Detection of nucleotide variability in rpoB in both rifampin-sensitive and rifampin-resistant strains ofChlamydia trachomatis［J］.Antimicrob Agents Chemother,2003,47（7）:2316-2318.

［3］江勇,楊麗娜,齊蔓莉,等.提高沙眼衣原體臨床株培養(yǎng)陽性率的探討［J］.中國麻風皮膚病雜志,2008,24（9）:706-708.

［4］Dreses-Werringloer U,Padubrin I,Zeidler H,et al.Effects of azithromycin and rifampin onChlamydia trachomatisinfectionin vitro［J］.Antimicrob Agents Chemother,2001,45（11）:3001-3008.

［5］Kutlin A,Kohlhoff S,Roblin P,et al.Emergence of resistance to rifampin and rifalazil inChlamydophila pneumoniaeand Chlamydia trachomatis［J］.AntimicrobAgentsChemother,2005,49（3）:903-907.

In vitroactivity of rifampin against and rpoB mutations inChlamydia trachomatisclinical isolates

Jiang Yong, Yang Lina,Liu Yuanjun,Hou Shuping,Qi Manli,Liu Quanzhong*.*Department of Dermatology and Venereology,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Liu Quanzhong,Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

Liu Quanzhong,Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate the susceptibility ofChlamydia trachomatisclinical isolates to rifampin,and assess the relationship between rpoB mutations and antibiotic resistance in them.MethodsA microculture method was used to determine the minimal inhibitory concentration（MIC）of rifampin in 52Chlamydia trachomatisclinical isolates. The rpoB gene was amplified from all the clinical isolates and a standard strain ofChlamydia trachomatisfollowed by single-strand conformation polymorphism（SSCP）analysis.Sequencing of PCR products was carried out for two clinical isolates.ResultsNo rifampin-resistant strain was found among these clinical isolates.The MIC of rifampin varied from 0.004 to 0.030 mg/L.Neither SSCP analysis nor sequencing showed rpoB mutations.ConclusionsNo rpoB mutations were found inChlamydia trachomatisisolates from patients unresponsive to rifampin.The unresponsiveness to rifampin may be attributed to multiple factors.

Chlamydia trachomatis;Rifampin;Microbial sensitivity tests;Drug resistance,microbial;DNA mutational analysis;Genes,rpoB

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.018

國家自然科學基金（30872285）

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院皮膚性病科［江勇（現在天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科，300211）、劉原君、侯淑萍、齊蔓莉、劉全忠）］；天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚性病科（楊麗娜）

劉全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

2014-12-31）

（本文編輯：尚淑賢）