付志成，馬妍，張?jiān)鰸?，劉日勇，何勇，范開

（1.重慶理工大學(xué)，重慶400054；2.富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶400041）

短C肽門冬胰島素制備工藝的研究

付志成1，馬妍1，張?jiān)鰸?，劉日勇2，何勇2，范開1

（1.重慶理工大學(xué)，重慶400054；2.富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司，重慶400041）

為研究門冬胰島素制備工藝，參照畢赤酵母偏好密碼子，設(shè)計(jì)合成N-端連接引導(dǎo)肽EEAEAEAEPK，以KEWK作為短C肽，A、B鏈結(jié)構(gòu)完整的門冬胰島素cDNA序列。利用Xho I-Not I酶切位點(diǎn)將其插入表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA，采用電轉(zhuǎn)移方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母x-33，篩選高拷貝重組子作為工程菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，表達(dá)量可達(dá)到0.57 g/L。發(fā)酵液經(jīng)金屬螯合層析和SP陽離子層析純化后鑒定正確。建立CPB/Trypsin雙酶切工藝，對(duì)不同溫度及pH條件下產(chǎn)生的酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，初步建立了酶切最佳pH值和溫度條件。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后制得純度為91.7%的門冬胰島素，副產(chǎn)物為B鏈30位缺失的門冬胰島素。該設(shè)計(jì)方法為含短C肽EWK門冬胰島素制備中選用Lys-c酶切成本過高的問題提供了備選解決方案。

門冬胰島素；畢赤酵母；短C肽；純化

門冬胰島素（Insulin Aspart，商品名Novo Rapid）由丹麥諾和諾德（Novo Nordisk）公司開發(fā)，是一種速效胰島素類似物，于2000年在美國(guó)上市［1］。其設(shè)計(jì)原理為通過基因重組將胰島素B鏈第28位脯氨酸（Pro）置換為天冬氨酸（Asp）。該陰離子的引入未改變其受體親和力、分離的速度及體內(nèi)的藥物效能，而是通過增大胰島素分子間的相互排斥阻止二聚體的形成，使其吸收速度為人胰島素的2倍［2］。Thim等［3］比較含不同長(zhǎng)度C肽與去除C肽胰島素原在畢赤酵母中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)C肽長(zhǎng)度由4個(gè)氨基酸殘基縮短至2 h，胰島素原的表達(dá)量上升。自此，C肽的設(shè)計(jì)成為胰島素重組表達(dá)中受到關(guān)注的問題，以期達(dá)到更高的表達(dá)量，降低胰島素的制備成本。Kjeldsen等［4］將去除B30蘇氨酸（Thr）后用小C肽代替人胰島素C肽或B29賴氨酸（Lys）與A1甘氨酸（Gly）直接連接的A、B鏈結(jié)構(gòu)連于前導(dǎo)肽α因子，提高了其在釀酒酵母中的分泌表達(dá)水平；而后發(fā)現(xiàn)在短C肽中引入一個(gè)芳香族氨基酸以及在分子疏水核心加入酚結(jié)合位點(diǎn)能夠使門冬胰島素在釀酒酵母中的表達(dá)量提高5倍［5］。Annibali［6］設(shè)計(jì)以賴氨酸（Lys）或精氨酸（Arg）構(gòu)成的2個(gè)氨基酸短肽的人胰島素原在畢赤酵母中得以表達(dá)。

國(guó)內(nèi)對(duì)于門冬胰島素的研究主要集中在以其為組成成分的預(yù)混胰島素類似物的藥理學(xué)特點(diǎn)［7］、在I型及II型糖尿病臨床應(yīng)用的研究［8］、在妊娠期糖尿病中應(yīng)用的安全性和有效性［9-10］，以及與二甲雙胍、阿卡波糖等降血糖藥物聯(lián)合用藥臨床效果［11］等方面，而對(duì)于門冬胰島素的重組表達(dá)和制備工藝所進(jìn)行的研究鮮有報(bào)道。筆者所在實(shí)驗(yàn)室曾設(shè)計(jì)構(gòu)建在α-MF信號(hào)肽序列后插入氨基酸序列EEAEAEAEPK作為引導(dǎo)肽，以EWK作為短C肽，B30Thr缺失的胰島素原，用pPICZαA為載體質(zhì)粒，畢赤酵母x-33作為表達(dá)菌株，構(gòu)建的表達(dá)Insulin Aspart的重組菌株發(fā)酵誘導(dǎo)64 hr表達(dá)量達(dá)到2.55 g/L。但在酶切處理過程中，常用的能切開賴氨酸（Lys，K）或精氨酸（Arg，R）的胰蛋白酶不能切除C肽，因此選用賴氨酸內(nèi)肽酶（Lys-c）進(jìn)行酶切去除引導(dǎo)肽和C肽。但有關(guān)該酶的文獻(xiàn)報(bào)道較少，制備需培養(yǎng)天然篩選菌株，產(chǎn)量較低，使用需向日本W(wǎng)ako公司購(gòu)買，成本較高。因此，設(shè)計(jì)N-端連接引導(dǎo)肽EEAEAEAEPK，以KEWK作為短C肽的A、B鏈結(jié)構(gòu)完整的門冬胰島素序列，IAsp：EEAEAEAEPK-B1-B28Asp-B29Lys-B30-K-E-W-K-A1-A21。以pPICZαA為載體質(zhì)粒，畢赤酵母x-33作為表達(dá)菌株，構(gòu)建篩選高表達(dá)菌株，建立成本較低的酶切工藝。

1　材料與方法

1.1材料

E.coli/Top10F'，P.Pastoris/x-33，表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA均由重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司保存；限制性內(nèi)切酶Xho I，NotⅠ，T-4 DNA連接酶購(gòu)自TAKARA公司；羧肽酶B（CPB），胰蛋白酶（Trypsin）由富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司制備；中分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自TIANGEN公司；Zeocin購(gòu)自邁晨科技（北京）有限公司；金屬螯合層析柱和離子交換層析柱填料均購(gòu)自GE公司。

LB培養(yǎng)基，MD、MY、YPG固體培養(yǎng)，BMMY、BMGY液體培養(yǎng)基等均參照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊(cè)進(jìn)行配制。

1.2方法

1.2.1重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp的構(gòu)建

根據(jù)設(shè)計(jì)門冬胰島素原的氨基酸序列組成，選擇酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)cDNA序列，其中TGA和TAA為兩個(gè)終止密碼子序列，并在序列5＇端和3＇端分別設(shè)計(jì)Xho I（CTCGAG）和Not I（GCGGCCGC）限制性酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)的cDNA委托寶生物工程（大連）有限公司全基因合成，連于pMD19-T質(zhì)粒。門冬胰島素基因序列如圖1所示。

圖1　門冬胰島素基因序列

將攜帶目的基因的甘油菌保接種于8 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)過夜后，取適量菌液，按Omega公司質(zhì)粒小提試劑盒操作，抽提重組質(zhì)粒pMD19-T-IAsp。利用Xho I-Not I分別雙酶切pMD19-T-IAsp質(zhì)粒和pPICZαA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別回收大小約200 bp和3300 bp片段并鏈接兩片段，構(gòu)建質(zhì)粒pPICZαAIAsp。重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp，用CaCl2法轉(zhuǎn)入E.coli Top10F'，涂布LB-Zeocin平板篩選重組子。挑取平板上菌落，搖瓶培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，經(jīng)Xho I-Not I雙酶切后，送大連寶生物公司測(cè)序。

1.2.2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母x-33

Sac I單酶切重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp，線性化質(zhì)粒電擊法轉(zhuǎn)入畢赤酵母x-33感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化液涂布在含有0.5，1，1.5，2 mg/mL Zeocin的YPD平板上，30℃培養(yǎng)4 d，每24 h觀察平板上菌落的生長(zhǎng)情況。

1.2.3重組子搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

根據(jù)重組拷貝數(shù)與Zoecin濃度計(jì)量依賴關(guān)系，于YPD-Zeocin平板（1.5 mg/mL）挑取pPICZαA -IAsp/x-33菌落，接種于50 mL BMGY培養(yǎng)基；在30℃、220 r/min搖床培養(yǎng)約16 h至OD600值約為10，換用BMMY培養(yǎng)液50 mL，30℃繼續(xù)培養(yǎng)96 h，按終濃度0.5%每隔24 h補(bǔ)加無水甲醇，將誘導(dǎo)96 h后的各單菌落搖瓶培養(yǎng)液離心收集上清，通過SDS-PAGE鑒定其表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4重組酵母的高密度發(fā)酵

將鑒定正確的高表達(dá)的菌株所保菌種接種于1L YPD培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)約24 h。配制BSM培養(yǎng)基9 L，于瑞士比歐生物工程公司30 L發(fā)酵罐中滅菌降溫至28℃后，氨水自控pH值到4.8，補(bǔ)加PTM1，用種子液接種進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)約24 h后培養(yǎng)基內(nèi)甘油耗盡，補(bǔ)加50%甘油補(bǔ)料，至菌體濕重約200 g/L，停止流加甘油并饑餓約1 h，開始流加含甲醇的甘油補(bǔ)料進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)起始甲醇終濃度為0.2%，隨發(fā)酵過程逐漸提高甲醇誘導(dǎo)濃度至0.6%，過程中取樣HPLC檢測(cè)分泌表達(dá)產(chǎn)物含量。發(fā)酵進(jìn)行至64 h后下罐收集離心上清。

HPLC檢測(cè)選用Welch UltimateR XB-C18（5μm 4.6×100 mm）；A液：DDW+0.1%三氟乙酸；B液：100%乙腈+0.1%三氟乙酸，為流動(dòng)相；流速為1 mL/min，0%～95%B；檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，上樣20 μL。目的蛋白保留時(shí)間為12.5 min，18 000 000 mAU峰面積為1 mg/L。

1.2.5表達(dá)產(chǎn)物的純化

金屬螯合柱純化：1 mol/L NaCl沖洗柱填料2個(gè)柱體積后，以20 mmol/L Na2HPO4，0.3 mol/L NaCl，pH值為6.5～7.0的緩沖液洗柱，直至穿出液pH值約為7.0；用0.1 mol/L CuSO4和0.3 mol/L NaCl混合液進(jìn)行再生，DDW沖洗未結(jié)合Cu2+；柱層析平衡液平衡（20 mmol/L Na2HPO4、0.3 mol/L NaCl、pH值為6.5～7.0）后上樣（發(fā)酵液離心取上清，將pH值調(diào)到7.0）；平衡液（20 mmol/L Na2HPO4、0.3mol/L NaCl、pH值7.0）復(fù)平衡至吸收基線，開始用洗脫液（20 mM Na2HPO4、50 mM咪唑、pH值6.5～7.0）洗脫，收集目的蛋白峰。

SP柱純化：平衡液（20 mmol/L CH3COONa、pH值為3.0～3.5）平衡柱填料，直至穿出液pH值約為3.5；上述洗脫液用去離子水稀釋至電導(dǎo)小于10 Ms/cm2，調(diào)pH值為3.0～3.5后上樣；平衡液復(fù)平衡至基線，洗脫液洗脫（20 mmol/L CH3COONa、1 mol/L NaCl、pH值為3.0～3.5），收集目的蛋白。與層析柱填料結(jié)合的色素可用1 mol/L NaOH除去。

1.2.6酶切體系建立

根據(jù)蛋白序列，需切除引導(dǎo)肽-EEAEAEAEPK-及C肽-KEWK-，形成正確的B1-B28Asp -B29-B30-A1-A21門冬胰島素序列。將SP陽離子柱層析收集樣品，采用HPLC法標(biāo)定濃度后，稀釋至濃度1 mg/mL，分裝后分別調(diào)節(jié)pH值至7.5和8.5，按以下比例設(shè)置實(shí)驗(yàn)組。表1中比例均為酶與底物質(zhì)量比，酶切過夜。HPLC檢測(cè)酶切結(jié)果，并通過質(zhì)譜比照判斷各個(gè)酶切條件的酶切效果。

表1Trypsin/CPB雙酶切比例

1.2.7酶切產(chǎn)物回收與分析

將樣品pH值調(diào)低到3.0，通過反相Source 15RPC純化回收目的蛋白。以Source 15RPC（75 mL）為制備柱。A液：0.1 M（NH4）2SO4，10%乙腈，0.1%H2SO4；B液：70%乙腈，10%甲醇為流動(dòng)相。洗脫梯度：5%B至25%B 5 min；25%B至40%B 30 min，收集各洗脫峰。

利用RP-HPLC對(duì)收集到的各個(gè)洗脫峰進(jìn)行鑒定，因C18普通反相不能有效分離Insulin Aspart與IAsp-DesB30組分，因而選用Kromasil 100 -10-C8分析柱。A液：90%緩沖，10%乙腈；B液：40%緩沖，60%乙腈作為流動(dòng)相。30%B至80%B 50 min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定

構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-IAsp后，經(jīng)Xho INot I雙酶切，結(jié)果如圖2所示，可見在3 300 bp和200 bp左右有明亮條帶，與理論值相符，證明重組質(zhì)粒含有設(shè)計(jì)的基因序列。測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列一致，說明編碼含短C肽門冬胰島素序列已連接入pPICZαA質(zhì)粒。

圖2　重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.2重組菌株的篩選與搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)

重組畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的表達(dá)量一定程度上受到基因組內(nèi)所整合編碼外源蛋白的基因拷貝數(shù)影響。由于選用的質(zhì)粒pPICZαA帶有Zeocin抗性基因，且重組子對(duì)Zeocin的抗性與外源基因的拷貝數(shù)在一定范圍內(nèi)成正比關(guān)系，故挑取1.5 mg/mL Zeocin濃度YPD平板上菌落作為工程菌株，搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)并進(jìn)行高密度發(fā)酵，考察表達(dá)量。

目的蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量為7 853.86，利用中分子蛋白Marker作為對(duì)照，能夠看到在低于14.4 kDa處有明顯條帶，初步判斷目的蛋白在重組菌株中能夠得以分泌表達(dá)。

圖3　重組子誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE

2.3工程菌發(fā)酵表達(dá)量

對(duì)所篩菌株進(jìn)行小規(guī)模高密度發(fā)酵，不僅能夠?qū)?gòu)建的工程菌株發(fā)酵條件進(jìn)行初步摸索，還能為后續(xù)純化及酶切提供足夠的樣品。依據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)以EWK作為短C肽pPICZαAIAsp（EWK）/x-33發(fā)酵工藝為參照，對(duì)本菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)，誘導(dǎo)64 h對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，表達(dá)量約為0.57 mg/L，見圖4。

圖4　發(fā)酵誘導(dǎo)表達(dá)64 h上清RP-HPLC檢測(cè)

2.4目的蛋白純化

發(fā)酵上清經(jīng)金屬螯合層析，SP柱純化后，以除去絕大部分雜蛋白和可能干擾酶切的色素，純化結(jié)果如圖5所示。雖經(jīng)Zn2+沉淀復(fù)溶后，能夠更加徹底地清除溶液中的色素，但Zn2+沉淀引入Zn2+可能干擾蛋白酶的酶切效率，而復(fù)溶需加入EDTA螯合Zn2+，EDTA為蛋白酶活性抑制劑。因此，經(jīng)兩步純化的樣品，多數(shù)色素被除去。純化終樣品RP-HPLC檢測(cè)如圖5，目的峰為單一峰，保留時(shí)間為12.5 min左右。

圖5　純化產(chǎn)物RP-HPLC檢測(cè)

2.5酶切處理結(jié)果

經(jīng)酶切處理樣品，利用C-18 RP-HPLC檢測(cè)，除可見引導(dǎo)肽C肽外，有3種主要酶切產(chǎn)物，結(jié)合質(zhì)譜結(jié)果分析，分別為錯(cuò)切B22Arg剩余多肽和帶有C肽未能切除的門冬胰島素原形式。在正確酶切產(chǎn)物峰中，混合了切除TKEWK的結(jié)構(gòu)，即B30Thr缺失的IAsp-DesB30。各個(gè)組分在不同酶切條件下所占比例如表2、3所示。

表2、3中：組分I為未被酶切門冬胰島素原；組分II為在B22Arg位點(diǎn)錯(cuò)誤切開的肽段；組分III為酶切正確的門冬胰島素蛋白；組分IV為帶有C肽KEW（K）而被切去引導(dǎo)肽的多肽鏈。由表2、3可知，pH值對(duì)酶切效率有一定的影響，高pH值可能造成錯(cuò)切率升高，低pH值則會(huì)造成未被酶切的門冬胰島素原過多。Trypsin1∶500，CPB1∶200，pH值8.5實(shí)驗(yàn)組雖然錯(cuò)切B22Arg的產(chǎn)物最多，但是其產(chǎn)物中酶切正確的Insulin Aspart所占比例也最高。由此，參照該實(shí)驗(yàn)方案，將制備樣品稀釋至4 mg/mL，Typsin與目的蛋白質(zhì)量比為1∶800，CPB與目的蛋白比為1∶200，pH值為8.5，20℃酶切5 h后，RP-HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖6所示。13.191 min保留峰經(jīng)高分辨質(zhì)譜測(cè)定分子量為5 826 Da，與理論分子量一致。

表2　酶切產(chǎn)物組分表（pH值為7.5）

表3　酶切產(chǎn)物組分表（pH值為8.5）

圖6　酶切產(chǎn)物RP-HPLC檢測(cè)

2.6酶切產(chǎn)物的回收與分析結(jié)果

利用15RPC對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，洗脫時(shí)分別收集4個(gè)洗脫峰，見圖7。對(duì)4個(gè)洗脫峰RP-HPLC進(jìn)行分析，并與標(biāo)準(zhǔn)品比照，可知峰3收集即為Insulin Aspart，見圖8。

圖7　酶切產(chǎn)物15RPC純化

圖8　15RPC收集峰RP-HPLC檢測(cè)

因副產(chǎn)物IAsp-DesB30與目的蛋白Insulin Aspart結(jié)構(gòu)類似，只有B30Thr缺失，C18-HPLC難以分離，因此選用Kromasil 100-10-C8柱對(duì)純化后酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖9。純化后的酶切產(chǎn)物已為純度較高的Insulin Aspart，其純度達(dá)到91.71%。

圖9　酶切回收峰3 Kromasil 100-10-C8檢測(cè)

3　結(jié)論

胰島素及胰島素類似物在畢赤酵母中的表達(dá)量不僅受到編碼外源蛋白基因特性的影響，蛋白本身結(jié)構(gòu)也是決定性因素之一。對(duì)于在畢赤酵母中表達(dá)胰島素及其前體，在質(zhì)粒信號(hào)肽α-MF序列和胰島素基因之間加入EEAEAEAEPK信號(hào)肽序列能有效地提高表達(dá)量。國(guó)內(nèi)多選擇以AAK作為短C肽提高胰島素或胰島素類似物Detmir前體（B30Thr缺失的人胰島素）［11］，而對(duì)門冬胰島素的報(bào)道并不多見。設(shè)計(jì)短C肽KEWK，在C肽中引入芳香族類氨基酸，以期能夠提高表達(dá)量。在工程菌株高密度表達(dá)的發(fā)酵過程中，外源蛋白表達(dá)量決定于菌種本身和外源蛋白的性質(zhì)，同時(shí)也受到的發(fā)酵環(huán)境的影響。參照畢赤酵母表達(dá)人胰島素前體發(fā)酵條件［11］，對(duì)構(gòu)建工程菌進(jìn)行高密度培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)門冬胰島素前體，64 h表達(dá)量為0.57 g/L。就本實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，為了酶切而在EWK序列前引入的氨基酸增加了C肽的長(zhǎng)度，很有可能是限制表達(dá)量的因素之一。發(fā)酵的表達(dá)量通過改變補(bǔ)料流加的時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)模式，有進(jìn)一步提升的潛力。

發(fā)酵上清液中所含無機(jī)鹽、色素及背景蛋白均會(huì)對(duì)門冬胰島素制備中的酶切造成干擾。畢赤酵母分泌表達(dá)胰島素原早期運(yùn)用硫酸銨沉淀后陰離子柱層析分離［12］，之后多用超濾或大孔樹脂吸附層析后經(jīng)SP離子交換層析，再經(jīng)Zn2+沉淀制得［11，13］。本文發(fā)現(xiàn)在目的蛋白不帶有組氨酸標(biāo)簽的情況下，胰島素前體能與銅金屬螯合層析柱填料結(jié)合，有效除去發(fā)酵液中背景蛋白，但對(duì)色素清除能力不強(qiáng)，故仍需使用SP離子交換層析去除部分色素。因酶切工藝易受到Zn2+和EDTA的干擾，故未進(jìn)行Zn2+沉淀與復(fù)溶的步驟，所得樣品經(jīng)HPLC檢測(cè)為單一峰，殘留少許色素，能夠滿足酶切需要，色素可在酶切后純化中被除去。

因含C肽的胰島素原不具有生物學(xué)活性，需切除短C肽的胰島素原［14］。故設(shè)計(jì)短C肽時(shí)，不僅需要考慮C肽對(duì)表達(dá)量的影響，還要考慮其在后續(xù)處理中純化酶切。羧肽酶B和胰蛋白酶常在重組蛋白表達(dá)后酶切加工時(shí)使用［15］，目前已經(jīng)完成了基因工程重組表達(dá)的研究，可利用工程菌大量制備，使得其生產(chǎn)或購(gòu)買的成本降低。使用CPB/Trypsin雙酶切體系，能夠被酶切的位點(diǎn)為B22Arg，B29Lys，以及C肽第1位和第4位的Lys，因此，若CPB作用與C肽第1位Lys切斷C端肽鍵，會(huì)在B鏈C端引入一個(gè)多余的Lys，而B29Lys仍可被內(nèi)肽酶作用，多余Lys連同B30Thr一同被切除，形成B鏈第30位缺失的門冬胰島素（IAsp-DesB30）。門冬胰島素B30缺失對(duì)藥效和藥代動(dòng)力學(xué)的影響研究目前還未見相關(guān)報(bào)道，所以需進(jìn)一步純化分離IAsp-DesB30，并應(yīng)用分離度較好的檢測(cè)方法作為質(zhì)量控制的手段。經(jīng)Kromasil 100-10-C8反相色譜檢測(cè)15 RPC制備柱純化后的樣品，酶切純化制得樣品門冬胰島素純度達(dá)到91.7%，雜質(zhì)即為IAsp-DesB30。該類物質(zhì)經(jīng)純化分離后可繼續(xù)加工，在B鏈末尾連接一個(gè)Thr，以制備門冬胰島素。

本實(shí)驗(yàn)將在以后的研究中對(duì)發(fā)酵的工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，提高產(chǎn)量，改進(jìn)酶切體系，提高酶切效率，減少錯(cuò)誤酶切的副產(chǎn)物，提高純化收率，為速效胰島素工業(yè)化生產(chǎn)提供幫助。

［1］滕香宇.新型胰島素類似物的研究進(jìn)展［J］.世界臨床藥物，2004，25（12）：714-717.

［2］Home P D，Lindholm A，Hylleberg B，et al.Improved glycemic control with insulin aspart：a multicenter randomized double-blind crossover trial in type 1 diabetic patients［J］.Diabetes Care，1998，21（11）：1904-1909.

［3］Thim L，Hansen M T，Norris K.et al.Secretion and processing of insulin precursors in yeast［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1986，83（18）：6766-6770.

［4］Kjeldsen T.Yeast secretory expression of insulin precursors［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2000，54（3）：277 -286.

［5］Kjeldsen T，Ludvigsen S，Diers I，et al.Engineering enhanced protein secretory expression in yeast with application to insulin［J］.J Biol Chem，2002，277（21）：18245 -18248.

［6］Annibali.Expression of a human insulin precursor in P［P］.pastoris US Patent，7，091，032.2006-08-15.

［7］董超.門冬胰島素30臨床應(yīng)用進(jìn)展［J］.山西醫(yī)藥雜志，2009，38（11）：991-992.

［8］李淑穎.胰島素類似物的研究進(jìn)展［J］.河北醫(yī)藥，2005，27（9）：693-694.

［9］于四永，王慧麗，陳永立，等.胰島素類似物治療妊娠期糖尿病的患者的臨床觀察［J］.臨床薈萃，2013，28（5）：573-575.

［10］呂詩(shī)詩(shī)，徐勇，劉霜，等.胰島素類似物治療妊娠期糖尿病的研究進(jìn)展［J］.臨床薈萃，2015，30（2）：228 -230.

［11］李紅亮.不同啟動(dòng)子對(duì)重組畢赤酵母高密度表達(dá)人胰島素前體的影響［D］.重慶：重慶理工大學(xué)，2012.

［12］高劍坤.一種新型長(zhǎng)效人胰島素類似物的研制［D］.重慶：重慶大學(xué)，2007.

［13］Xie T，Liu Q，Xie F，et al.Secretory expression of insulin precursor in Pichia pastoris and simple procedure for producing recombinant human insulin［J］.Prep Biochem Biotechnol，2008，38：308-317.

［14］吳穎.小C肽人胰島素原在甲醇酵母中的分泌表達(dá)［D］.浙江：浙江大學(xué)，2005：6-7.

［15］Chunsheng Leng，Hang Cui.Application of recombinant enzymes in the production of human insulin［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Science，2011，23（5）：335 -337.

（責(zé)任編輯何杰玲）

Research on Preparation of Insulin Aspart with Short C-Peptide

FU Zhi-cheng1，MA Yan1，ZHANG Zeng-tao2，LIU Ri-yong2，HE Yong2，F(xiàn)AN Kai1
（1.Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China；2.FAGEN Biological Medicine Co.Ltd.，Chongqing 400041，China）

In order to study the preparation techniques of insulin aspart，we designed and linked EEAEAEPK to its N-terminal，referring to the preference codons of pichia pastoris，and took KEWK as C-peptide，which was a synthetise insulin aspart cDNA sequence with integrated A，B chain structure.We inserted the target sequence into expression plasmid pPICZαA by the restriction enzyme sites Xho I and Not I.The combination of P.Pastoris/x-33 was constructed by electrotransformation and the high-yield strain was selected.The combinant strain expressed 0.57 g/L at the 64th hours of fermentation.We obtained the purer insulin aspart precursor from broth through metal ion-affinity chromatography，SP ion-exchange chromatography and the result of authentication was correct.The system of enzyme digestion by CPB/Trypsin was established and probed the effect in different pH and temper-ature.The product after enzyme digestion was made into insulin aspart and the by-product was insulin aspart DesB30.The purity of insulin aspart reached 91.7%.This design would be another choice to the preparation of insulin aspart，compared with which with short C-peptide EWK，as its high cost in use of Lys-c.

insulin aspart；pichia pastoris；short C-peptide；purification

R977.15

A

1674-8425（2015）04-0060-07

10.3969/j.issn.1674-8425（z）.2015.04.012

2015-01-26

付志成（1990—），男，碩士研究生，主要從事基因工程藥物方面研究。

付志成，馬妍，張?jiān)鰸?，?短C肽門冬胰島素制備工藝的研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2015（4）：60-66.

format：FU Zhi-cheng，MA Yan，ZHANG Zeng-tao，et al.Research on Preparation of Insulin Aspart with Short CPeptide［J］.Journal of Chongqing University of Technology：Natural Science，2015（4）：60-66.