韓梅+董俊+邵華斌+等

摘要：空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是引起人類細(xì)菌性腹瀉的主要人畜共患病原菌之一，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致人類格林-巴利綜合征。其中雞肉污染導(dǎo)致的食源性傳播是人類感染的重要原因。為了調(diào)查武漢市雞肉制品的空腸彎曲菌污染情況，運(yùn)用最可能數(shù)法（MPN）及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)結(jié)合，即MPN-PCR方法，對(duì)市場(chǎng)采集的128份雞肉樣品進(jìn)行了空腸彎曲菌的定量檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性檢出率為18.75%，其中鮮雞肉檢出率為28.26%，凍雞肉檢出率為13.41%，含菌量范圍為3.6～92.0 MPN/g。

關(guān)鍵詞：空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）；MPN-PCR法；定量檢測(cè)

中圖分類號(hào)：TS207.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-5084-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.040

Quantitative Detection of Campylobacter jejuni in Chicken Products

by MPN-PCR in Wuhan

HAN Mei1，2，DONG Jun1，SHAO Hua-bin1，LUO Ling1，LUO Qing-ping1，PAN Ling2，ZHANG Teng-fei1

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China；2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Abstract： Campylobacter jejuni was one of the most common zoonosis pathogen which caused human bacterial diarrhea， and could lead to Guillian-barre syndrome in severe cases. Human being infected with C. jejuni was most from foodborne transmission caused by chicken products contamination. In order to investigate the contamination of C. jejuni in chicken products in Wuhan，128 chicken products were collected from the markets in Wuhan and detected by most probable number （MPN） method combined with Polymerase chain reaction （PCR）.The results showed that the positive rate of C. jejuni was 18.75%， in which the positive rate in fresh chicken and frozen chicken was 28.26%， and 13.41%，respectively.The content of C. jejuni was from 3.6 to 92.0 MPN/g.

Key words： Campylobacter jejuni ； MPN-PCR； quantitative detection

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）是近年來(lái)影響動(dòng)物源性食品安全的主要人畜共患病原菌之一，是引起全世界人類細(xì)菌性腹瀉的主要食源性致病菌，與沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella castellani）并列為人類三大腹瀉致病菌，嚴(yán)重者可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等，還與格林-巴利綜合征密切相關(guān)。該菌廣泛存在于家禽腸道中，并通過(guò)污染肉品、食物或水源導(dǎo)致人類感染[1-3]。鑒于空腸彎曲菌對(duì)食品安全和公眾健康造成嚴(yán)重的威脅，控制食品中空腸彎曲菌的污染并加強(qiáng)食品中空腸彎曲菌的監(jiān)測(cè)具有重要意義。

常規(guī)PCR、熒光定量PCR等檢測(cè)技術(shù)只能對(duì)反應(yīng)體系中模板DNA進(jìn)行定量，無(wú)法鑒別與區(qū)分污染食品中的細(xì)菌為死菌還是活菌。MPN法（Most probable number，最可能數(shù)法）采用多管發(fā)酵法，通過(guò)概率計(jì)算，測(cè)定樣品中含有細(xì)菌的最可能數(shù)，該方法已用于食品病原菌及工農(nóng)業(yè)微生物的定量檢測(cè)[4，5]。本研究利用空腸彎曲菌的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)合MPN法，對(duì)市場(chǎng)上的雞肉進(jìn)行了空腸彎曲菌的快速定量檢測(cè)，為調(diào)查雞肉中空腸彎曲菌的帶菌狀況提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni ATCC 33291）標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心，該菌分離自人的糞便。

1.2 試劑與儀器

2 000 bp DNA Marker、小量細(xì)菌DNA提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。2×Es Taq MasterMix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。Bolton肉湯（GB標(biāo)準(zhǔn)）、Bolton肉湯添加劑、布氏肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。脫纖維無(wú)菌裂解馬血購(gòu)自廣州蕊特生物科技有限公司。厭氧培養(yǎng)罐和微需氧產(chǎn)氣袋均購(gòu)自O(shè)XOID公司。超細(xì)勻漿器（型號(hào)：F6/10-8G）購(gòu)自上海弗魯克公司。endprint

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)參考Linton等[6]的方法設(shè)計(jì)并合成了特異性擴(kuò)增空腸彎曲菌特有的馬尿酸酶hipO基因的引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為735 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列如下：HIP400F：5′-GAAGAGGGTTTGG

GTGGTG-3′，HIP1134R：5′-AGCTAGCTTCGCATAA

TAACTTG-3′。

1.3.2 樣品采集 按照食品樣品的采樣方法從湖北省武漢市超市與生鮮市場(chǎng)分次采集雞肉樣品128份，其中新鮮雞肉46份，凍雞肉82份。用保鮮袋包好采集的樣品于冰盒中運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。

1.3.3 樣品處理及增菌培養(yǎng) 將采集的肉樣剪碎，并稱取約10 g放入200 mL的無(wú)菌燒杯中，加入90 mL布氏肉湯，用超細(xì)勻漿器進(jìn)行勻漿，獲得勻漿液，將其以5個(gè)連續(xù)稀釋度進(jìn)行10倍系列稀釋。取1 mL稀釋液加入9 mL Bolton肉湯增菌液中，每個(gè)稀釋度接種3管，42 ℃微需氧環(huán)境下增菌培養(yǎng)48 h。

1.3.4 模板制備及PCR擴(kuò)增 取2 mL上述增菌培養(yǎng)的樣品，12 000 r/min 離心5 min，棄上清液，用50 μL 滅菌水重新懸浮沉淀，置于100 ℃水浴中煮沸5 min，冰浴5 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清液作為PCR模板。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL，包括：2×Es Taq MasterMix 10 μL（包括Es Taq DNA Polymerase， 2×Es Taq PCR Buffer，3 mmol/L MgCl2， 400 μmol/L dNTP mix），DNA模板5 μL，上下游引物各1 μL，滅菌去離子水8 μL 。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。配制1%瓊脂糖凝膠，取8 μL PCR產(chǎn)物加樣，120 V電壓電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照、分析試驗(yàn)結(jié)果。

如果在735 bp處出現(xiàn)特異性條帶，即可判斷樣品中含有空腸彎曲菌。按照劉淑艷等[7]研究的MPN法稀釋度選擇原則，選擇3個(gè)連續(xù)稀釋度，查最可能數(shù)表[8]，根據(jù)空腸彎曲菌出現(xiàn)的陽(yáng)性管數(shù)情況，計(jì)算空腸彎曲菌的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 MPN-PCR法檢測(cè)空腸彎曲菌的靈敏性

將濃度為1.4×108 CFU/mL 的空腸彎曲菌菌液進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個(gè)梯度3個(gè)平行，42 ℃微需氧條件增菌培養(yǎng)后，提取模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并根據(jù)最終出現(xiàn)的陽(yáng)性管數(shù)查MPN表，結(jié)果最低檢測(cè)限為3.6 MPN/g。而直接對(duì)倍比稀釋的樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無(wú)法檢測(cè)到該濃度的細(xì)菌，說(shuō)明該方法相比直接進(jìn)行PCR檢測(cè)顯著提高了檢測(cè)靈敏度。MPN-PCR法整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括樣品處理、增菌培養(yǎng)、模板制備、PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對(duì)空腸彎曲菌的快速定量檢測(cè)。

2.2 雞肉中空腸彎曲菌的檢測(cè)

本研究運(yùn)用MPN-PCR法對(duì)部分市場(chǎng)128份雞肉樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果（表1）表明雞肉中空腸彎曲菌的污染率為18.75%，其中鮮雞肉和凍雞肉均有不同程度的污染，陽(yáng)性檢出率分別為28.26%和13.41%。

根據(jù)檢測(cè)樣品的PCR陽(yáng)性管數(shù)，查閱MPN值表，獲得鮮雞肉與凍雞肉空腸彎曲菌陽(yáng)性樣品的菌含量范圍分別為3.6～92.0 MPN/g和9.2～92.0 MPN/g，其含菌量分布見圖1，顯示鮮雞肉與凍雞肉的含菌量主要集中在3.6～20.0 MPN/g范圍內(nèi)，其中部分樣品含菌量高達(dá)92.0 MPN/g。

3 小結(jié)與討論

空腸彎曲菌是引起急性腹瀉的主要病原菌，近年來(lái)彎曲菌腸炎在人群腸道感染中所占的比例不斷上升，空腸彎曲菌已成為發(fā)達(dá)國(guó)家最主要的腹瀉病原菌之一[9]。歐盟以及很多國(guó)家明確規(guī)定出口到該地區(qū)的禽肉制品中不得檢出空腸彎曲菌。本次檢測(cè)武漢市雞肉樣品共檢出24份空腸彎曲菌污染的雞肉，檢出率達(dá)18.75%，含菌量范圍在3.6～92.0 MPN/g。表明武漢市禽肉制品中存在較為嚴(yán)重的空腸彎曲菌污染，還需加強(qiáng)對(duì)在售食品中空腸彎曲菌的監(jiān)測(cè)及控制，也提示人們一定要注意食品衛(wèi)生，食用加熱徹底的熟食。

此次檢測(cè)的128份雞肉樣品中，鮮雞肉的檢出率為28.26%，凍雞肉的檢出率為13.41%，鮮雞肉的陽(yáng)性率高于凍雞肉，與文獻(xiàn)[1，10，11]報(bào)道中兩類雞肉樣品檢測(cè)結(jié)果一致，可能是由于新鮮雞肉在屠宰、加工、銷售等過(guò)程中的交叉污染，致使新鮮雞肉帶菌增加。凍雞肉中也可檢出空腸彎曲菌，可能目的菌在凍雞肉上處于“活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)”（Viable but non-culturable state，VBNC）。有大量報(bào)道指出許多細(xì)菌可以逃避正規(guī)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入VBNC狀態(tài)，其本身喪失了生長(zhǎng)及繁殖的能力，無(wú)法用常規(guī)培養(yǎng)方法檢測(cè)，但其仍然具有代謝活性，在DNA合成抑制劑的作用下，添加一定量的營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)時(shí)，在一定條件下可以復(fù)蘇，并具有與正常狀態(tài)下原菌相似的致病能力[12，13]。食源性病原菌一旦進(jìn)入VBNC狀態(tài)，常常會(huì)造成漏檢，從而引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)。因此生禽肉類加工銷售企業(yè)自身必須建立內(nèi)部衛(wèi)生質(zhì)量保證體系，并配合檢驗(yàn)檢疫部門的衛(wèi)生檢驗(yàn)及監(jiān)督，以保證生禽肉制品的生產(chǎn)銷售安全。

對(duì)空腸彎曲菌采用生化試驗(yàn)的方法進(jìn)行鑒定步驟繁瑣，采用平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行定量檢測(cè)誤差較大，且容易漏檢VBNC狀態(tài)的細(xì)菌，采用MPN-PCR法對(duì)空腸彎曲菌進(jìn)行定量檢測(cè)簡(jiǎn)單易行，是一種非常有效的方法。

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