范秀芝 陳麗冰 史德芳 等

摘要：以菌絲長速和濃密程度、液體發(fā)酵菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量為考核指標(biāo)，從22個國審黑木耳（Auricularia auricula-judae）品種中篩選高產(chǎn)多糖的菌株，并對其發(fā)酵特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黑木耳2號菌株菌絲濃白、生長速度快，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中獲得多糖產(chǎn)量是其他菌株的2倍以上，是較優(yōu)的液體發(fā)酵高產(chǎn)菌株；發(fā)酵第五天多糖產(chǎn)量最高，在后續(xù)培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗中可在此時終止發(fā)酵。

關(guān)鍵詞：黑木耳（Auricularia auricula-judae）；液體發(fā)酵；多糖；菌株篩選

中圖分類號：S646.6；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）20-5117-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.049

Screening of Auricularia auricula-judae Strain with High Polysaccharide Contents for Liquid Fermentation and Analysis on the Fermentation Characteristics

FAN Xiu-zhi，CHEN Li-bing，SHI De-fang，CHENG Wei，HE Jian-jun，GAO Hong

（Institute of Agri-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064， China）

Abstract：Using mycelial growth rate， colony dense degree， liquid mycelium biomass and polysaccharide production as assessment indicator， high polysaccharides yield Auricularia auricula-judae strain was screened from 22 state approved strains， and the fermentation characteristics of the selected strain was analyzed. The results demonstrated that the polysaccharide production of HME2 with thick white and growth fast mycelia was two times more than that of other strains in basic fermentation medium， which showed that HME2 was the optimum liquid fermentation producing strain. The highest polysaccharide yield of HME2 was obtained at the 5th day， indicating that in the subsequent optimization of fermentation culture media and conditions test could be terminated at this time.

Key words： Auricularia auricula-judae； liquid fermentation； polysaccharide； strain selection

黑木耳（Auricularia auricula-judae）又名木耳、云耳和光木耳，是一種質(zhì)地柔軟、口感細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富的食用菌，含有大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)、鈣、磷、鐵、胡蘿卜素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。同時，也含有多種生物活性物質(zhì)，是一種重要的藥用菌，被稱為益壽延年的妙藥和抗癌新兵[1]。黑木耳多糖是黑木耳中研究最多的活性物質(zhì)。研究表明，黑木耳多糖可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能，增強機體免疫能力[2]；通過誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡來抑制癌細(xì)胞增殖[3]；抗氧化、防衰老，并可通過抗氧化活性增強心臟功能[4]；有食品阿司匹林之稱，抗凝血、抗血栓，還可以降血糖、降血脂、降低膽固醇，有利于防治高血脂、動脈硬化，減少心血管疾病的發(fā)生，另外還有抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗輻射和抗突變等多種功效[5-8]。

從黑木耳子實體中提取胞內(nèi)多糖是獲得黑木耳多糖的主要方法，但考慮到黑木耳的生產(chǎn)受季節(jié)和氣候的影響較大，而且栽培周期長，勞動強度大，提取工藝繁瑣以及提取率低等因素，不少研究者將目光轉(zhuǎn)向能夠短時間高效獲取目的代謝產(chǎn)物，而且不受季節(jié)、地域和時間限制，并可規(guī)模化、工業(yè)化生產(chǎn)的液體深層發(fā)酵技術(shù)[9，10]。但是不同黑木耳品種間多糖含量差異較大[11]，因此本研究以菌絲體形態(tài)、生物量及胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量為考核指標(biāo)，篩選適用于液體發(fā)酵的黑木耳高產(chǎn)多糖菌株，并對發(fā)酵特性進(jìn)行分析，為進(jìn)一步利用液體深層發(fā)酵技術(shù)獲得黑木耳多糖奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

22株國審黑木耳菌株（表1）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所保藏并提供。通過活化后比較在90 mm平板中菌絲生長速度和濃密程度，選擇其中7株用于高產(chǎn)多糖黑木耳液體發(fā)酵用菌株的篩選。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

完全培養(yǎng)基（CYM）：葡萄糖20 g，蛋白胨2.0 g，酵母膏2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，KH2PO4 0.46 g，瓊脂15～20 g，加蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌備用。

液體完全培養(yǎng)基（LCYM）：不添加瓊脂的CYM。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（BFM）：葡萄糖20 g，酵母膏2.0 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，加蒸餾水定容至1 L，高壓滅菌備用，自然pH。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化 將4 ℃保存的菌株分別轉(zhuǎn)接到90 mm 含CYM平皿上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用直徑8 mm打孔器沿邊緣取相同菌齡的菌塊備用。

1.3.2 菌株長速測定和菌落形態(tài) 取直徑8 mm的菌塊，菌絲面向上接種到90 mm CYM平皿中央，在平皿底劃“+”線，于25 ℃恒溫培養(yǎng)，至第一個平皿長滿后停止培養(yǎng)，觀察菌株的菌落形態(tài)、菌絲濃密程度。并采用十字交叉法測量菌落平均直徑，計算各菌株的菌絲生長速度（mm/d）。每個試驗重復(fù)3次。

1.3.3 菌球直徑和生物量測定 將“1.3.1”中獲得的8 mm的菌塊接種到50 mL LCYM中用于發(fā)酵種子液，25 ℃靜置培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)結(jié)束后用勻漿器將菌絲勻漿，并按10%的接種量將勻漿液接種到100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。每個試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束，將培養(yǎng)基連同菌球經(jīng)6 000 r/min離心10 min，收集菌液，并用蒸餾水清洗菌球2遍。隨機選取10個菌球排成直線用游標(biāo)卡尺測其直徑。60 ℃烘干至恒重，稱菌球生物量干重。

1.3.4 胞內(nèi)和胞外多糖測定 菌體胞內(nèi)多糖提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線制定及含量測定參照文獻(xiàn)[12]。胞外粗多糖及純度測定：將“1.3.3”中收集的菌液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至30～40 mL，加入4倍體積無水乙醇，4 ℃沉淀過夜。6 000 r/min離心10 min棄上清液，沉淀用無水乙醇洗滌2次。將沉淀烘干至恒重，得胞外粗多糖。粗多糖研碎后稱取0.050 0 g用蒸餾水溶解后定容至100 mL。適當(dāng)稀釋后按照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行測定，計算得到胞外粗多糖含量。多糖含量以葡萄糖計，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用苯酚硫酸法。

1.3.5 菌株發(fā)酵特性分析 選定8 d為一個培養(yǎng)周期，對培養(yǎng)周期中菌球干重、胞內(nèi)和胞外粗多糖含量、pH以及還原糖含量進(jìn)行測定。還原糖含量測定參照文獻(xiàn)[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株菌絲生長速度和菌落形態(tài)比較

7個菌株的菌絲生長速度差異顯著，菌絲生長速度最快的是黑耳5號（圖1A）。菌落形態(tài)可分為3類：新科和單片5號菌絲較稀疏（++），氣生菌絲較發(fā)達(dá)；黑木耳2號、黑耳5號和黑793，菌絲平貼，濃白致密（++++）；黑威981和Au8129菌絲濃密度介于前兩組之間（圖1B）。菌絲生長速度與菌落形態(tài)間無明顯相關(guān)性。通過比較選擇黑木耳2號、黑耳5號和黑793菌株用于液體發(fā)酵菌株的復(fù)篩。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

紫外分光光度計在波長490 nm處測得葡萄糖含量，線性回歸處理后，繪制葡萄糖溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，其回歸方程為：y=9.452 9x-0.002 5（R2=0.999 7），標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.3 液體發(fā)酵菌球直徑、生物量、胞內(nèi)和胞外多糖含量比較

發(fā)酵培養(yǎng)6 d后的復(fù)篩菌株菌球直徑、生物量、胞內(nèi)和胞外粗多糖含量測定結(jié)果見表2。從表2中可以看出，同樣條件下黑木耳2號的菌球直徑最小，但生物量、胞內(nèi)和胞外粗多糖含量最高，其發(fā)酵多糖總量為1.239 g/L。因此，選擇黑木耳2號用于后續(xù)發(fā)酵試驗研究。

2.4 黑木耳2號菌株發(fā)酵特性分析

配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外分光光度計測定540 nm處吸光度，得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=15.665x-0.020 5（R2=0.998 5）。

在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d的一個周期內(nèi)，黑木耳2號菌株的生物量從第二天開始呈上升趨勢，在第七天達(dá)到最大，為8.40 g/L；但菌絲體胞內(nèi)多糖含量存在差異，隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，在第五天達(dá)到最高（圖3A）。發(fā)酵液內(nèi)胞外粗多糖含量隨培養(yǎng)時間增加不斷增加，但其多糖純度存在差異，第五天粗多糖的純度最高，多糖產(chǎn)量也最高，胞外多糖產(chǎn)量在達(dá)到峰值后略有下降?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基自然條件下pH偏酸（5.04），在發(fā)酵過程中隨菌絲體生長，pH不斷下降。發(fā)酵過程中，葡萄糖的利用呈直線下降，在第八天培養(yǎng)結(jié)束后，葡萄糖殘留量為5.02 g/L，利用率約為75%。綜合考察發(fā)酵過程中生物量、胞內(nèi)和胞外粗多糖含量，在后續(xù)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗中，以多糖為評價指標(biāo)時，應(yīng)選擇搖瓶發(fā)酵時間為5 d。

3 討論

不同黑木耳品種間多糖含量差異較大，本試驗在有限的菌株范圍內(nèi)篩選到多糖產(chǎn)量高的黑木耳2號菌株，但因培養(yǎng)基為基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件人為設(shè)定，使得所得的生物量和胞外粗多糖含量都比其他報道低。已知多糖的合成與培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件關(guān)系很大，因此在后續(xù)試驗中需要對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得更高的生物量和多糖產(chǎn)量，以便于進(jìn)一步加工和利用。

pH是影響多糖產(chǎn)生的一個重要因素：蜜環(huán)菌產(chǎn)多糖的最適初始pH 5.0；靈芝產(chǎn)胞外多糖的最適初始pH為5.5，且在發(fā)酵過程中控制pH在4.0時，胞外多糖的產(chǎn)量最高[14]。據(jù)報道，黑木耳菌絲體較適合偏酸性環(huán)境，在初始pH 4.5～5.5時適宜生長[15]，因此后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化試驗中可直接選擇初始pH 5.0左右。

本研究中，利用黑木耳2號在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵多糖產(chǎn)量最高是在第五天，胞外純多糖僅占多糖總量的26.96%，遠(yuǎn)低于王國良等[16]發(fā)酵生產(chǎn)黑木耳多糖時的99.77%，這一差異的出現(xiàn)是否與培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件有關(guān)還需進(jìn)一步探明。發(fā)酵第五天，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖剩余量為9.89 g/L，利用率只有50.55%，但胞內(nèi)、胞外多糖產(chǎn)量已達(dá)到最高值，因此，在將含有殘留葡萄糖的發(fā)酵液直接用于產(chǎn)品開發(fā)研究中，葡萄糖利用率不會成為限制因素。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 玉.中國黑木耳[M].長春：長春出版社，2001.

[2] 張會新，劉洪雨，劉 暢，等.黑木耳多糖對小鼠免疫功能的影響[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（7）：23-25.

[3] MA Z， WAN J， ZHANG L， et al. Evaluation of water soluble β-D-glucan from Auricularia auricular-judae as potential anti-tumor agent[J]. Carbohydrate Polymers，2010，80：977-983.

[4] WU Q， TAN Z P， LIU H D， et al. Chemical characterization of Auricularia auricula polysaccharides and its pharmacological effect on heart antioxidant enzyme activities and left ventricular function in aged mice[J]. International Journal of Biological Macromolecules， 2010， 46（3）： 284-288.

[5] 宗燦華，于國萍.黑木耳多糖對糖尿病小鼠降血糖作用[J].食用菌，2007（4）：60-61.

[6] CHEN G， LUO Y C， JI B P， et al. Effect of polysaccharide from Auricularia auricula on blood lipid metabolism and lipoprotein lipase activity of ICR mice fed a cholesterol-enriched diet[J]. Journal of Food Science， 2008， 73（6）： 103-108.

[7] YOON S J， YU M A， PYUN Y R， et al. The nontoxic mushroom Auricularia Auricula contains a polysaccharide with anti-coagulant activity mediated by antithrombin[J]. Thrombosis Research，2003，112（3）：151-158.

[8] 趙夢瑤，孔學(xué)瓊，張擁軍，等.不同處理工藝對黑木耳多糖抑菌活性影響研究[J].中國食用菌，2011，30（2）：34-36.

[9] 唐青濤，余若黔，陳福生.深層發(fā)酵黑木耳產(chǎn)孢外多糖的初步研究[J].食品科學(xué)，2002，23（3）：46-49.

[10] 孟麗君，王 芳，張玉萍.黑木耳液體菌種的制備條件及應(yīng)用研究[J].食用菌，2009（6）：25-26.

[11] 史岳紅，鮮 喬，張擁軍.不同品種黑木耳多糖含量差異的研究[J].浙江食用菌，2009，17（5）：15-17.

[12] NY/T 1676—2008，食用菌中粗多糖含量的測定[S].

[13] 張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法與技術(shù)[M].第二版.北京：高等教育出版社，1997.

[14] 譚周進(jìn)，謝達(dá)平，王 征，等.蜜環(huán)菌胞外多糖的發(fā)酵條件研究[J].微生物學(xué)通報，2002，29（3）：33-37.

[15] 王 謙，賈 震.不同條件對黑木耳液體深層發(fā)酵的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，31（1）：74-78.

[16] 王國良，王志江，蔡景順，等.黑木耳菌絲體發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵罐生產(chǎn)多糖的試驗[J].農(nóng)業(yè)科技通訊，2009（1）：59-61.