閘雯俊 李三和 胡剛 等

摘要：凝集素類受體蛋白激酶（Lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶。采用RT-PCR 從水稻（Oryza sativa L.）品種B5中克隆了OsLecRK基因靠近翻譯起始位點(diǎn)下游的530 bp 的特異基因片段，將該片段以正、反向分別連入pKANNIBAL載體，從而獲得pKAN-OsLecRK-RNAi的中間表達(dá)載體，進(jìn)而將其克隆到植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301中，構(gòu)建dsRNAi表達(dá)載體pCAMBIA-OsLecRK-dsRNAi。經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，通過抗性篩選和標(biāo)記基因hyg進(jìn)行PCR鑒定，篩選出12株轉(zhuǎn)基因水稻植株。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；RNAi；OsLecRK；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）20-5149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.20.056

Construction and Genetic Transformation of RNA Interference Vectors

for OsLecRK Gene of Oryza sativa L.

ZHA Wen-jun， LI San-he， HU Gang， CHEN Zhi-jun， LIU Kai， ZHOU Lei， YANG Guo-cai， YOU Ai-qing

（Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement/Food Crops Institute，

Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： Lectin-like receptor kinase（lecRK） is a family of proteins which is unique and universal in plants. A 530 bp gene specific fragment of OsLecRK was amplified using RT-PCR method from rice variety B5 and this fragment was linked both in sense and antisense directions to the vector of pKANNIBAL as junction fragment. The resulting construct was then cloned into plant binary expression vector pCAMBIA1301 to form dsRNAi expression vector pCAMBIA-OsLecRK-RNAi. After confirmation by enzyme digestion and sequencing analysis， this pCAMBIA-OsLecRK-RNAi was transferred into rice by agrobacterium-mediated transformation method. A total of 12 regenerated transgenic lines were screened through PCR identification of hyg gene.

Key words： Oryza sativa L.；RNA interference；OsLecRK；genetic transformation

水稻（Oryza sativa L.）是世界的主要糧食作物之一，全球超過一半人口以水稻作為主食[1]。水稻是中國最重要的口糧作物，常年種植面積約3 000萬hm2，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻的種植安全與中國農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和口糧安全密不可分。

凝集素類受體蛋白激酶（lectin-like receptor kinase，LecRK）是一類植物特有并分布廣泛的蛋白激酶。自1996年從擬南芥中第一次分離得到該家族成員Ath.lecRK1后，人們已從多種植物中克隆到多個(gè)該類蛋白基因。研究表明，LecRK基因?qū)χ参锷L發(fā)育有一定的作用。擬南芥sgc是一種LecRK基因失活的突變體，由T-DNA插入At3g53810而引起，突變體sgc由花粉時(shí)期開始，所有的花粉粒都開始變形和萎縮，從而引起雄性不育[2]。LecRK基因還廣泛參與植物與生物和非生物脅迫的互作。LecRK胞外的凝集素受體結(jié)構(gòu)域一直被認(rèn)為是與根瘤菌的共生和病原體的抵抗相關(guān)。最近的研究也證明了這個(gè)觀點(diǎn)，新發(fā)現(xiàn)的水稻抗稻瘟病Pi-d2就是一種包含有甘露糖特異的凝集素受體蛋白激酶[3]。研究人員還利用T-DNA插入和RNAi方法將擬南芥中的LecRK4.1、LecRK4.2、LecRK4.3這3個(gè)基因分別敲除掉，結(jié)果顯示任一基因的失活可增強(qiáng)擬南芥對(duì)萌發(fā)時(shí)ABA的應(yīng)答[4]；與之相反，另一株突變體LecRK-b2在萌發(fā)時(shí)期對(duì)ABA的敏感度會(huì)降低，同時(shí)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)LecRK-b2基因也參與發(fā)育早期對(duì)鹽壓力和滲透壓的應(yīng)答[5]。

RNAi（RNA interference）即RNA干擾（或RNA干涉），是在生物進(jìn)化過程中遺留下來的，其在轉(zhuǎn)錄后通過 RNA 調(diào)控基因表達(dá)，在真核細(xì)胞中引入雙鏈 RNA分子從而導(dǎo)致具有序列同源性的基因產(chǎn)生特異性基因沉默（Gene silencing）的現(xiàn)象。RNAi具有高效性和高度特異性，成為調(diào)控基因表達(dá)的新技術(shù)。因此，本研究旨在通過RNAi技術(shù)，研究OsLecRK下調(diào)的轉(zhuǎn)基因水稻，為深入研究OsLecRK基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 供試水稻品種為合江19，購自國家種質(zhì)資源庫，以下簡稱H1493。

1.1.2 質(zhì)粒與菌種 大腸桿菌（E. coli）DH5α和農(nóng)桿菌EHA105。所使用的載體包括pCAMBIA1301載體、pCU載體和pKANNIBAL載體，載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 工具酶及主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、HindⅢ、pMD19-T 載體、T4 連接酶購自于寶生物工程（大連）有限公司。試劑：蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素、卡那霉素等抗生素購自于Sigama公司；Taq DNA polymerase、pfu DNA polymerase、dNTPs、DNA凝膠回收試劑盒等購自康為世紀(jì)生物科技（北京）有限公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、核酸分子量 Marker 購自天根生化科技（北京）有限公司； 其余常規(guī)藥品均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 采用小量DNA提取方法提取水稻品種B5基因組 DNA。以B5基因組 DNA 為模板，OsLecRKXE和OsLecRKXH為引物，分別擴(kuò)增兩段OsLecRK 基因530 bp的順式和反式片段。PCR反應(yīng)體系：10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各 0.5 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序： 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s， 56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將其PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行回收，回收片段經(jīng)加尾 polyA后與克隆載體 pMD19- T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

1.2.2 RNAi重組載體的獲得 擴(kuò)增靶標(biāo)片段連入pMD-19T載體測序正確后，從pMD19-T載體上使用XhoⅠ+EcoRⅠ雙酶切切下順向靶標(biāo)片段（OsLecRK）并連入pKANNIBAL載體，構(gòu)成載體pKAN- OsLecRK XE。同樣從pMD19-T載體上使用XbaⅠ+HindⅢ雙酶切切下反向靶標(biāo)片段OsLecRK連入載體pKAN-OsLecRK XE，構(gòu)成重組載體pKAN-（OsLecRK）2。目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)接頭中，中間被Pdk內(nèi)含子隔開，即形成dsRNAi片段。最后利用BamHⅠ酶切載體pKAN-（OsLecRK）2得到所需的dsRNAi片段，連入經(jīng)BamHⅠ酶切的pUC載體，構(gòu)成RNAi載體。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻的獲得鑒定 將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，在含有50 μg/μL卡那霉素和50 μg/μL利福平的平板培養(yǎng)基上篩選，單菌落以O(shè)sLecRKXE為引物進(jìn)行PCR鑒定。將鑒定正確的單菌落進(jìn)行搖菌，待菌液為OD600 nm約0.5時(shí)，侵染預(yù)先培養(yǎng)好的日本晴愈傷組織，28 ℃暗培育2.5 d；將愈傷組織挑出放入無菌三角瓶中，用含500 mg/L頭孢拉定的無菌水清洗干凈；晾干后放入含500 mg/L潮霉素培養(yǎng)基上篩選15 d，共篩選2次；將培養(yǎng)基上能增生分裂的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培育基上，一周后愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠；將其轉(zhuǎn)到裝有分化培育基的三角瓶中，約3周后，愈傷組織長出嫩芽并生根；待根部發(fā)育粗壯、苗高約6～10 cm時(shí)，打開瓶蓋進(jìn)行煉苗；一周后移栽大田。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因水稻的鑒定 提取水稻的總DNA，具體步驟按試劑盒說明操作。以Hyg-F/Hyg-R為引物對(duì)進(jìn)行抗性基因檢測，PCR反應(yīng)體系為：10×PCR反應(yīng)緩沖液2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μL， MgCl2（25 mmol/L）2 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，上、下游引物（10 μmol /L） 各0.5 μL，質(zhì)粒1 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNAi干擾片段的克隆

以模式抗蟲水稻品種B5 mRNA為模板，采用RT-PCR 擴(kuò)增（NCBI accession number：Os04g 12560）

靠近翻譯起始位點(diǎn)ATG帶有特定限制性酶切位點(diǎn)的530 bp長的正反義片段，結(jié)果與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

2.2 OsLecRK RNAi載體的構(gòu)建

分別選擇OsLecRK基因編碼區(qū)的530 bp作為該基因的目的片段，用于構(gòu)建RNAi載體轉(zhuǎn)化水稻。OsLecRK使用正向引物帶有XhoⅠ+BamHⅠ酶切位點(diǎn)和反向引物帶有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，連入pMD19-T載體測序正確后，從pMD19-T載體上使用XhoⅠ+EcoRⅠ雙酶切切下靶標(biāo)片段OsLecRK并連入pKANNIBAL載體，構(gòu)成載體pKAN-OsLecRKXE（圖2）。

然后再使用正向引物帶有XhaⅠ+BamHⅠ酶切位點(diǎn)和反向引物帶有Hind III酶切位點(diǎn)擴(kuò)增靶標(biāo)片段，pMD19-T載體測序正確后，從pMD-19T載體上使用XbaⅠ+Hind Ⅲ雙酶切切下靶標(biāo)片段OsLecRK連入載體pKAN-OsLecRKXE，構(gòu)成載體pKAN-（OsLecRK）2（圖3）。

目的片段以相反的方向克隆到pKANNIBAL載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)接頭中，中間被Pdk內(nèi)含子隔開，獲得pKAN-OsLecRK-RNAi的中間表達(dá)載體。使用BamHⅠ酶切載體pKAN-（OsLecRK）2，得到dsRNAi片段，連入經(jīng)BamHⅠ酶切的pCU載體，構(gòu)成RNAi載體（OsLecRK-RNAi）（圖4）。

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將構(gòu)建好的RNAi載體（OsLecRK-RNAi）利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，以粳稻品種合江19為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化水稻。以靶標(biāo)基因和潮霉素設(shè)計(jì)引物，通過PCR進(jìn)行鑒定OsLecRK-RNAi（圖5），獲得OsLecRK-RNAi陽性轉(zhuǎn)化植株。

3 小結(jié)與討論

RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)是反向遺傳學(xué)重要的試驗(yàn)技術(shù)手段之一，具有特異性和高效性，是研究基因功能的有效途徑之一[6]，它的應(yīng)用為闡明基因生物學(xué)功能提供了有利的工具。相關(guān)研究表明，有效的靶基因片段對(duì) RNA干擾的成功非常重要，基因片段長度在 23～1 000 bp間都能獲得良好的沉默效果[7]。

為了研究和驗(yàn)證OsLecRK基因的生物學(xué)功能，通過反向遺傳學(xué)的方法，敲除水稻OslecRK基因，構(gòu)建了RNAi抑制轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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