鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

冷鮮肉中新霉素殘留快速檢測(cè)法的研究

鮑會(huì)梅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，江蘇淮安223003）

建立高效液相色譜法檢測(cè)冷鮮肉中新霉素殘留量的方法，以甲醇含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣10 μL，在260、315 nm波長(zhǎng)出檢測(cè)。外標(biāo)法定量的方法檢出值為0.035 mg/kg，在添加水平為50 ng/g～250 ng/g范圍內(nèi)的平均回收率為81.98%～84.89%。表明該方法適用于冷鮮肉中新霉素殘留的定量分析。

冷鮮肉；新霉素；快速檢測(cè)；高效液相色譜法

新霉素屬氨基糖苷類抗生素藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌有極好的抑制作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和獸藥領(lǐng)域。在獸醫(yī)臨床上，新霉素是治療畜禽細(xì)菌性腸炎的首選藥物之一，但是新霉素吸收毒性大，其毒副作用主要表現(xiàn)為耳毒性和腎毒性，殘留物對(duì)人體健康危害較大。隨著新霉素在國(guó)內(nèi)外畜牧養(yǎng)殖業(yè)中越來越廣泛地應(yīng)用，它在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生殘留的問題也日益嚴(yán)重。世界上多個(gè)國(guó)家和組織限制肌肉組織中新霉素的最大殘留量，中國(guó)、歐盟、日本公布最大殘留限量是0.5 mg/kg，美國(guó)規(guī)定的新霉素殘留量最大限量是1.2 mg/kg［1］。

有關(guān)新霉素含量測(cè)定的化學(xué)方法報(bào)道很多，這些方法主要是用來測(cè)定藥物制劑中的新霉素含量，很少被應(yīng)用到生物材料中。用于測(cè)定生物材料中新霉素殘留的方法主要有微生物法，高效液相色譜法（HPLC），酶聯(lián)免疫測(cè)定法（ELISA）。HPLC是目前應(yīng)用最廣泛的測(cè)定激素的方法［2］，它可分析熱穩(wěn)定性差的、沸點(diǎn)高、摩爾質(zhì)量大的有機(jī)物，具有選擇性高、快速、相對(duì)比較簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。采用高效液相色譜法，通過對(duì)樣液的提取以及衍生化條件的優(yōu)化，建立對(duì)冷鮮肉中新霉素殘留的快速檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：乙脂、甲醇、三乙胺、磷酸、氯化鈉（以上均為色譜純）、混合提取液、洗脫液、鄰苯二甲醛試劑；冷鮮肉：雙匯，天瑪特超級(jí)市場(chǎng)采購(gòu)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶液的配制

精密稱取硫酸新霉素標(biāo)準(zhǔn)品14.10 mg，用去離子水定容至10 mL，得到濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液.倒入棕色瓶中，置于-18℃保存，按實(shí)驗(yàn)需求加以稀釋。

1.3 主要儀器

液相色譜儀（配有熒光檢測(cè)器）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速搗碎機(jī)：上?？婆d商貿(mào)有限公司；振蕩器：鞏義市英峪予華儀器廠；離心機(jī)：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；陽離子交換柱：瑞士TECAN Genios。

1.4 方法

1.4.1 色譜選擇

色譜柱為 Waters Atlantis C18色譜柱 ；Waters-2475熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為260、315 nm；流動(dòng)相為77.5%甲醇水溶液含0.09 mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸；流速1.0 mL/min；柱溫35℃；進(jìn)樣10 μL。

1.4.2 樣品處理及萃取

取一定量的冷鮮肉于高速搗碎機(jī)中搗碎，備用。

稱取經(jīng)處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和2 g氯化鈉，震蕩30 min，經(jīng)過濾為80 μm～120 μm的過濾漏斗抽濾，殘?jiān)没旌舷礈煲合礈?。合并濾液與洗液于250 mL燒杯中。在沸水下加熱30 min，取下，于3 000 r/min離心20 min，置于4℃冰箱中冷卻200 min。然后經(jīng)濾孔40 μm～80 μm的過濾過濾漏斗抽濾，收集濾液待衍生化。

1.4.3 衍生化

將濾液注入陽離子交換柱中，用10 mL水洗柱，棄去流出液。將1 mL鄰苯二甲醛試劑注入柱中，反應(yīng)5 min，然后加2 mL洗脫劑洗脫柱上衍生物。棄去前面1 mL洗脫液，收集后面1 mL洗脫液，立即放置-18℃冰箱中，15 min后進(jìn)行液相色譜測(cè)定。

1.4.4 工作曲線

取6個(gè)編號(hào)為1、2、3、4、5、6的10 mL比色管，分別加入新霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.8、2、4、20、40 μL（濃度為0.00、0.08、0.20、0.40、2.00、4.00 μg/mL）。用去離子水定容到刻度，然后進(jìn)行液相色譜測(cè)定，記錄峰面積，以新霉素濃度為橫坐標(biāo)x，以峰面積為縱坐標(biāo)y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.4.5 樣品的檢測(cè)

將收集的樣品洗脫液稀釋一定的濃度，使其濃度在線性范圍內(nèi)，上機(jī)檢測(cè)峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查出新霉素濃度，再根據(jù)1.4.6公式計(jì)算出冷鮮肉中新霉素的殘留量。

1.4.6 結(jié)果計(jì)算

按下面公式計(jì)算：

式中：X為新霉素殘留量，（mg/kg）；A為樣液中新霉素衍生物的峰面積，mm2；C為新霉素衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液中相當(dāng)于硫酸新霉素濃度，（μg/mL）；V為最終樣液的體積，mL；a為新霉素衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液中新霉素衍生物峰面積，mm2；m為最終樣液相當(dāng)?shù)脑嚇恿浚琯；0.855為由硫酸新霉素?fù)Q算成新霉素的換算系數(shù)。

1.4.7 樣品提取的優(yōu)化

1.4.7.1 提取液的選擇

分析乙酰丙酮-甲醛、磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽-三氯乙酸溶液等對(duì)冷鮮肉中新霉素提取率的影響，得出最佳提取劑。

1.4.7.2 蛋白質(zhì)沉淀劑的選擇

稱取經(jīng)處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和分別加入三氯乙酸、氯化鈉、鹽酸各2 mL，所得提取液經(jīng)鄰苯二甲醛衍生化后，上機(jī)檢測(cè)，比較回收率，確定最佳蛋白質(zhì)沉淀劑。

1.4.7.3 提取液pH對(duì)試驗(yàn)影響

在最佳提取劑提取的樣品溶液pH調(diào)至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，經(jīng)衍生化后，上機(jī)檢測(cè)，觀察響應(yīng)值的變化。

1.4.8 衍生化條件的優(yōu)化

1.4.8.1 衍生化試劑濃度的確定

配制濃度為3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的鄰苯二甲醛溶液，取不同濃度的鄰苯二甲醛溶液與新霉素溶液衍生15 min，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.8.2 衍生化時(shí)間的選擇

將新霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1mL稀釋液鄰苯二甲醛溶液衍生4、7、10、13、15、17、20 min，分別上機(jī)檢測(cè)。

1.4.8.3 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1 mL稀釋液鄰苯二甲醛溶液衍生15 min，上機(jī)檢測(cè)，每隔2小時(shí)檢測(cè)一次。

1.4.9 檢測(cè)條件的優(yōu)化

1.4.9.1 淋洗液淋洗次數(shù)的優(yōu)化

取10 g空白樣品經(jīng)過2.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用堿性緩沖液—甲醇（1+4）洗脫，分別洗脫4、5、6次，比較每次洗脫液中新霉素的回收率。

1.4.9.2 不同C18柱的選擇

分別采用 CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18進(jìn)行檢測(cè)，比較新霉素的回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷鮮肉中新霉素殘留量的測(cè)定結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按試驗(yàn)方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1和圖1。

表1 數(shù)據(jù)記錄Table 1 Data record

圖1 新霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Neomycin standard curve

由圖1可知，新霉素濃度在0.00 μg/mL～4.5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，求得的線性方程為Y=1 016.2x+1.580 4，R2=0.999 9。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知冷鮮肉中新霉素含量的峰面積為387.0，代人2.4.6公式中，求得冷鮮肉中新霉素含量0.035mg/kg（國(guó)標(biāo)0.02 mg/kg～0.5 mg/kg）。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

分別取5份衍生化后的樣液，在其他檢測(cè)條件相同的情況下，運(yùn)用上述方法進(jìn)行多次檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)Table 2 Precision experiment

通過對(duì)同一樣品不同濃度的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)該測(cè)定方法的精密度進(jìn)行檢測(cè)，從表2可知，從樣品批間變異系數(shù)和批內(nèi)變異系數(shù)的數(shù)值比較，結(jié)果表明其檢測(cè)重復(fù)性好，精密度較高，符合精密度好的要求。

2.1.3 回收率試驗(yàn)

在冷鮮肉的勻漿中添加一定體積的新霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使各組織中藥物濃度分為50、100、250 ng/g進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行。結(jié)果見表3。

表3 樣品添加回收實(shí)驗(yàn)Table 3 Sample addition recovery experiments

從表3中可以看出，冷鮮肉中新霉素的回收率為81.98%～84.89%。

因此，這種測(cè)定方法的精密度及準(zhǔn)確度是可靠的，所以該方法是可行的。

2.2 樣品提取的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的選擇

在10 g的檢樣中各加60 mL乙酰丙酮-甲醛、磷酸鹽緩沖液-乙腈、磷酸鹽-三氯乙酸溶液等對(duì)冷鮮肉中新霉素進(jìn)行提取。結(jié)果如表4。

表4 樣品提取劑的提取率Table 4 Sample extraction agent and the extraction rate of

由表4可知，磷酸鹽緩沖液-乙腈的提取率為93.2%，比乙酰丙酮-甲醛和磷酸鹽-三氯乙酸提取率高。采用乙酰丙酮-甲醛和磷酸鹽-三氯乙酸緩沖溶液作為提取劑，由于提取劑用量過少，樣品勻漿黏度過大，吸附力增強(qiáng)，影響回收；如果提取劑過多，過柱時(shí)交換量降低，回收率也低。而本文采用磷酸鹽緩沖液-乙腈溶液作提取劑，提取后加熱，不但除去了蛋白質(zhì)還可以揮發(fā)掉乙腈，減少了溶劑的體積，提高了柱的交換量，回收率也相應(yīng)提高。因此，本文提取劑最佳選擇是磷酸鹽緩沖液-乙腈溶液。

2.2.2 蛋白質(zhì)沉淀劑的選擇

稱取經(jīng)處理后的試樣約10.0 g于100 mL錐形瓶中，加入60 mL混合提取液和分別加入三氯乙酸、氯化鈉、鹽酸各2 mL，所得提取液經(jīng)鄰苯二甲醛衍生化后，上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果見表5。

表5 樣品提取液的輔助劑的比較Table 5 Comparison of auxiliary agent liquid extraction sample

由表5看出，氯化鈉做樣品提取液輔助劑的回收率最高，三氯乙酸和鹽酸的酸度高不適宜樣液衍生化，而氯化鈉屬中性物質(zhì)，可抑制蛋白質(zhì)以及其產(chǎn)物對(duì)新霉素的吸附，大大的提高了新霉素的回收率，保證了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及精密性。因此，氯化鈉是最佳的樣液提取劑的輔助劑。

2.2.3 提取液pH對(duì)試驗(yàn)影響

在磷酸鹽緩沖液-乙腈提取的樣品溶液pH調(diào)至5.0、6.0、7.6、8.2、9.0、11.0，經(jīng)衍生化后，上機(jī)檢測(cè)，觀察響應(yīng)值的變化。結(jié)果如表6所示。

表6 提取液pH對(duì)試驗(yàn)影響Table 6 Effect of 3-6 extract on experimental pH

由表6可知，提取液pH10.5，檢測(cè)器響應(yīng)值最大。以及樣品在堿性環(huán)境中比較容易進(jìn)行。由此，提取液最佳pH是10.5。

2.3 衍生化條件的優(yōu)化

2.3.1 衍生化試劑濃度的確定

配制濃度為3.0、4.0、6.0、7.5、9.0、11.0、14.0 mol/mL的鄰苯二甲醛溶液，取不同濃度的鄰苯二甲醛溶液與新霉素溶液衍生15 min，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果如表7和圖2。

表7 衍生化試劑測(cè)定表Table 7 Derivatization reagent for measuring meter

圖2 衍生化試劑測(cè)定Fig.2 Derivatization reagent for determination of

結(jié)果如表7和圖2顯示，衍生化試劑鄰苯二甲醛在0～7 mol/mL左右，隨著濃度的升高，樣品的回收率也隨之增高，當(dāng)鄰苯二甲醛濃度達(dá)到8（mol/mL）之后，回收率趨于平穩(wěn)，綜上所述，在試驗(yàn)中衍生化試劑鄰苯二甲醛的最佳濃度為7.6 mol/mL。

2.3.2 衍生化時(shí)間的選擇

將新霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0 mg/L，分別取1mL稀釋液與鄰苯二甲醛溶液衍生1、3、5、7、9、15 min，分別上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果如圖3表8所示。

圖3 衍生化時(shí)間選擇圖Fig.3 Derivatization Time Selection Chart

結(jié)果從圖3表8可以看出，剛開始隨著衍生時(shí)間的延長(zhǎng)，被檢樣品的響應(yīng)值逐漸增高，當(dāng)衍生5 min后，檢測(cè)器的響應(yīng)值逐漸下降趨于平穩(wěn)，由此可知，衍生化最佳時(shí)間是5 min，能使待檢樣品響應(yīng)值最大，檢測(cè)的靈敏度越高。

表8 衍生化時(shí)間選擇表Table 8 Derivatization time selection table

2.3.3 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)

將新霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成1.0mg/L，分別取1mL稀釋液與鄰苯二甲醛溶液衍生15 min，上機(jī)檢測(cè)，每隔2小時(shí)檢測(cè)一次。結(jié)果表9。

表9 衍生化產(chǎn)物穩(wěn)定性檢測(cè)表Table 9 Derivatization product stability testing table

從表9可知，從檢測(cè)開始曲線趨于平緩，響應(yīng)值較為穩(wěn)定，但8h后，曲線大幅下降，衍生物在0h～8h之間較為穩(wěn)定，8h后變性。由此表明，在檢測(cè)過程中避免衍生物變質(zhì)，應(yīng)控制在8h內(nèi)檢測(cè)完畢，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.4 檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.4.1 淋洗液淋洗次數(shù)的優(yōu)化

取10 g空白樣品經(jīng)過1.4.3后，加入100 μL的200 μL/mL的新霉素，用堿性緩沖液—甲醇（1+4）洗脫，分別洗脫4、5、6次，洗脫液中新霉素的回收率如圖4。

圖4 不同淋洗次數(shù)下的回收率Fig.4 Recovery rate under different leaching times

從圖4可以看出，當(dāng)淋洗液淋洗到第五次時(shí)，此時(shí)響應(yīng)值很高，回收率也在90%以上，達(dá)到檢測(cè)的要求。如果淋洗次數(shù)過多，會(huì)影響衍生化試劑的衍生效力，同時(shí)影響淋洗液的pH，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)最佳淋洗次數(shù)為5次。

2.4.2 C18柱的選擇

分別采用CleanertC18、Waters Atlantis C18、AccubondIIC18進(jìn)行檢測(cè)，新霉素的回收率如表10。

表10 不同C18柱比較表Table 10 Different C18column comparison table

如表10可知，CleanertC18、AccubondIIC18回收率分別為87.88%、80.32%，Waters Atlantis C18的回收率為99.12%，由此可知，Waters Atlantis C18的回收率最高，因此，Waters Atlantis C18柱是本實(shí)驗(yàn)的最佳選擇。

3 結(jié)論與討論

建立高效液相色譜法測(cè)定冷鮮肉中新霉素殘留量。最終得到以下結(jié)論：以75.5%甲醇溶液含0.09mol/L三乙胺和0.45 mol/L磷酸為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣10 μL，在260、315 nm波長(zhǎng)出檢測(cè)。外標(biāo)法定量的方法檢出值為0.035 mg/kg，在添加水平為50 ng/g～250 ng/g范圍內(nèi)的平均回收率為81.98%～84.89%。由于新霉素沒有發(fā)光基團(tuán)，檢測(cè)前必須經(jīng)過對(duì)樣品衍生化。通過對(duì)樣品提取及衍生化條件的優(yōu)化，得到樣品的最佳提取溶劑是磷酸鹽緩沖液-乙腈，在pH7.6時(shí)檢測(cè)的靈敏度最強(qiáng)。確定衍生化試劑鄰苯二甲醛在7.5 mol/mL的濃度下衍生效果最佳，衍生時(shí)間控制在15 min最佳，衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性能持續(xù)8 h。通過本實(shí)驗(yàn)表明：該方法靈敏、可靠，準(zhǔn)確度和精密度良好，前處理過程簡(jiǎn)單易行，便于操作，大大提高了樣品的檢測(cè)效率，且檢測(cè)限低，適用于冷鮮肉新霉素殘留量的檢測(cè)。

［1］FAO/WHO，in：Residues of Some Veterinary Drugs in Animalsand Foods，Monographs Prepared by the 52nd Meeting of theJoint FAO/ WHO Expert Committee on Food Additives［R］.Rome，1999，133

［2］陳壬荃，陳桂良，新霉素及其他氨基糖苷類抗生素的分光光度快速測(cè)定［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，25（2）：79

Cold Meat Neomycin Residues Rapid Detection Method Research

BAO Hui-mei

（Jiangsu food vocational technical college of engineering food and nutrition，Huai'an 223003，Jiangsu，China）

This paper established a hig h-performance liquid chromatography assay for the detection of cold fresh meat of neomycin residues in method，with methanol containing three 0.09 mol/L and 0.45 mol/L phosphoric acid as mobile phase，flow rate of 1.0 mL/min，column temperature was 35℃，sampling 10 μL，in 260，315 nm wavelength detection.External standard method for quantitative detection value was 0.035 mg/kg，in addition level as 50 ng/g～250 ng/g range the average recovery rate was 81.98%～84.89%.Show that the method is suitable for the quantitative analysis of neomycin residue in chilled meat.

chilled meat；neomycin；rapid detection；high performance liquid chromatography

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.030

2014-11-12

鮑會(huì)梅（1974—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：食品檢測(cè)。