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不同劑量鄭氏三七散動(dòng)物腎細(xì)胞毒理學(xué)研究

2015-11-20 02:53
關(guān)鍵詞:鄭氏肌酐腎臟

曹 雪

Chengdu Sport University,Chengdu Sichuan 610041

鄭懷賢的傷科內(nèi)服經(jīng)驗(yàn)方鄭氏三七散,由四制香附、三七、當(dāng)歸、甘草為主要原料構(gòu)成,主要用于治療由急性閉合性軟組織損傷引起的肢體局部腫脹、疼痛、功能障礙等,特別適用于急性肌肉、肌腱和韌帶等損傷,其療效顯著,得到了廣泛的驗(yàn)證。但由于種種原因,其毒理性方面的知識(shí)還不太明了。有許多學(xué)者對(duì)鄭氏傷科配方[1-3]及按摩手法[4-8]進(jìn)行了一些研究,其研究結(jié)論證明鄭氏的傷科配方和治療手法具有非常明顯的療效。但是目前對(duì)鄭氏三七散的毒理方面的研究較少。據(jù)文獻(xiàn),在一些中藥及其制劑中,其含有的毒素成分具有直接或者間接導(dǎo)致腎臟的腎小管的損傷和壞死[9]。這些研究都證實(shí)了一些中藥成分對(duì)腎臟具有危害的作用,前人的的研究成果為本研究提供了一些理論依據(jù)[10]。本研究通過給大鼠服用不同劑量的鄭氏三七散進(jìn)行動(dòng)物干預(yù)實(shí)驗(yàn),并檢驗(yàn)相關(guān)的病理學(xué)指標(biāo),以此來了解服用不同劑量的鄭氏三七散對(duì)腎細(xì)胞是否造成危害,以期對(duì)鄭懷賢教授的配方加以推廣。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物材料

健康雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠48只,3月齡,體重282.40±17.34g,由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)物許可證號(hào):SCXK(111)-10-2006。動(dòng)物飼養(yǎng)采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料,飲用水為清潔自來水。動(dòng)物房室溫維持18-25℃,相對(duì)濕度30%-50%。

1.2 指標(biāo)檢測用儀器及試劑

測試儀器:半自動(dòng)干式生化分析儀(sysmexk21n,美國);切片機(jī)(LEICA RM 2135,德國);全自動(dòng)包埋機(jī)(LEICA EG 1150H,德國);病理組織漂片儀(Leica HB 1210,德國);病理組織烘片儀(Leica HI 1220,德國);OLYMPUS BX51顯微鏡(日本)以及OLYMPUSDP70照相系統(tǒng)。

測試試劑:中藥材均購自成都同康藥房有限責(zé)任公司。指標(biāo)檢測使用試劑:尿素氮(BUN)試劑盒(sysmex-k21n分析儀配套試劑);肌酐(Cr)測試盒(sysmex-k21n分析儀配套試劑)。二甲苯、甲醛、95%乙醇、HE染料石蠟等均為市購。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)藥物制備

將鄭氏三七散中的四制香附、三七、甘草按照《鄭懷賢醫(yī)著集粹》[11]的方法制成散劑。制備過程參照《中華人民共和國藥典》[12]及《中藥制劑學(xué)》[13]有關(guān)散劑的制備方法制備。鄭氏三七散常規(guī)劑量組按照人與動(dòng)物間藥物服藥劑量的換算:常規(guī)劑量每次用藥量為鄭氏三七散生藥0.22g,將其水煎制成含生藥量0.11g/mL,2mL/次。使用常規(guī)劑量的2倍、3倍用藥量分別制成中等劑量組和大劑量組用藥,即中等劑量組水煎劑含量為鄭氏三七散生藥量0.22g/mL,2mL/次。大劑量組水煎劑含生藥0.44g/mL,2mL/次。制好的藥劑保存在4℃的冰箱中備用,服用前水浴加熱到37℃。

1.3.2 動(dòng)物分組與給藥

SD雄性大鼠48只,體重282.40±17.34g。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,觀察大鼠有無異常情況。然后隨機(jī)分為四組:空白對(duì)照組、常規(guī)劑量組,中等劑量組和大劑量組,每組12只。

造模分組1小時(shí)后開始給藥,采用灌胃給藥液方法,2次/天,共3周。對(duì)照組采用同樣的方法灌服等量溫開水。

1.3.3 取材及標(biāo)本處理

各組實(shí)驗(yàn)大鼠于干預(yù)后3周末取材,分別稱取SD大鼠體重,記錄并作為實(shí)驗(yàn)后體重。根據(jù)經(jīng)濟(jì)合作和發(fā)展組織(OECD)相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行仁慈處死動(dòng)物。采用剪斷血管取血,將血放置在對(duì)應(yīng)的試管中備用;取血后進(jìn)行頸椎脫臼處死法,取出大鼠左側(cè)腎臟并去除包膜,稱重后放置在對(duì)應(yīng)的4%甲醛溶液中固定備用。

血液指標(biāo)處理:末次灌胃1小時(shí)后,在右股動(dòng)脈無菌條件下取血5mL測定。

腎組織處理:將腎臟包膜外的軟組織去除,經(jīng)過預(yù)處理后檢驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行處理,描述統(tǒng)計(jì)和參數(shù)分析用于該研究的數(shù)據(jù)分析,描述統(tǒng)計(jì)的所有變量的數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示,參數(shù)分析采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行比較分析,顯著水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象基本情況

2.1.1 樣本情況

實(shí)驗(yàn)過程中觀察,服用不同劑量鄭氏三七散和對(duì)照組大鼠一般情況良好,皮毛光澤,糞便性狀顏色正常,食量未見異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)大鼠的樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì),除對(duì)照組1只死亡,中等劑量組1只不符合要求外,其余各組大鼠成活并符合取材條件。

2.1.2 大鼠體重生長變化情況

SD大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室即進(jìn)行編號(hào)記錄,每天記錄大鼠體重等指標(biāo)。其0、1、2、3周各組體重見表1所示,在上述時(shí)間點(diǎn)各組的體重經(jīng)單因素ANVOA分析,在0、1、2、3 周體重沒有顯著性差別(F=2.62,P=0.15>0.05;F=1.78,P=0.19>0.05;F=2.35,P=0.17>0.05;F=1.12,P=0.35>0.05)。實(shí)驗(yàn)中各組大鼠的體重增隨著時(shí)間增加而增加。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠不同時(shí)相體重比較(單位:g)

2.2 各組大鼠鏡檢結(jié)果

服用不同劑量鄭氏三七散各組大鼠與空白對(duì)照組之間的腎組織細(xì)胞光鏡下顯示(見圖1所示)有如下特點(diǎn):各組大鼠的腎臟的腎單位結(jié)構(gòu)狀況完整,沒有出現(xiàn)水腫和萎縮等異常癥狀,各組大鼠腎臟的腎細(xì)胞沒有出現(xiàn)變性及壞死情況;各組大鼠的腎臟的腎間質(zhì)之間正常,沒有觀察到各類細(xì)胞浸潤及結(jié)締組織增生的現(xiàn)象出現(xiàn)。

2.3 各組大鼠腎臟重量和腎臟系數(shù)

不同劑量鄭氏三七散及對(duì)照組的腎臟重量及腎臟系數(shù)值見表2所示,對(duì)腎臟重量及腎臟系數(shù)值分別進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn),結(jié)果顯示腎臟重量(F=0.97,P=0.241>0.05)和腎臟系數(shù)(F=1.47,P=0.138>0.05)在不同劑量組以及對(duì)照組組之間沒有顯著性差異。

表2 不同劑量鄭氏三七散對(duì)腎臟重量及腎臟系數(shù)的影響

2.4 血液生化指標(biāo)結(jié)果

不同劑量鄭氏三七散對(duì)血液中尿素氮及肌酐的含量見表3所示,對(duì)尿素氮和肌酐檢測分別進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn),結(jié)果顯示尿素氮(F=2.16,P=0.138>0.05)和肌酐(F=3.49,P=0.215>0.05)不同劑量組以及對(duì)照組組之間沒有顯著性差異。

圖1 不同劑量組大鼠腎組織細(xì)胞切片觀察(×40)

表3 不同劑量鄭氏三七散對(duì)血液中尿素氮及肌酐的影響

3 分析與討論

大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的某些臟器,一般選用腎臟、心臟、肺、腦或者陴等器官,用某一器官的重量以及該器官的重量與其體重的比值及作為重要的評(píng)價(jià)指標(biāo),該指標(biāo)在毒理學(xué)安全性體系評(píng)價(jià)中經(jīng)常用作衡量受試動(dòng)物是否受到異常的環(huán)境的影響而產(chǎn)生變化。本研究選取實(shí)驗(yàn)大鼠的腎臟重量和腎臟系數(shù)來作為檢測值其目的是為了更直觀方便地了解實(shí)驗(yàn)大鼠腎臟本身的變化情況。從服用不同劑量的大鼠與空白對(duì)照組的大鼠之間的腎臟重量與腎臟系數(shù)來看,服用不同劑量鄭氏三七散各組大鼠的該值與對(duì)照組相比沒有多大差別。腎臟系數(shù)處于正常值范圍之內(nèi),可以斷定服用不同劑量的鄭氏三七散對(duì)大鼠腎臟系數(shù)沒有多大的改變,因此認(rèn)為該配方在這一指標(biāo)上不會(huì)使大鼠的腎臟產(chǎn)生毒理學(xué)的改變。

作為體內(nèi)多種藥物代謝的器官腎臟,在對(duì)動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),有許多研究報(bào)道[14-16]藥物的毒性反應(yīng)使得腎臟受到損害。檢測腎臟受到傷害,一般把腎組織切片,然后經(jīng)過HE染色后,對(duì)其進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)從病理切片的定性角度分析實(shí)驗(yàn)大鼠的腎細(xì)胞的損害情況。其結(jié)果顯示服用不同劑量的各組大鼠與空白對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)大鼠一樣,其腎臟的腎單位結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)完整狀況,服用不同劑量鄭氏三七散與空白對(duì)照組大鼠的腎單位皆未出現(xiàn)水腫、萎縮等異常情況,各組大鼠的腎細(xì)胞也沒有出現(xiàn)變性及壞死狀況,各類細(xì)胞浸潤及結(jié)締組織增生的癥狀也沒有出現(xiàn)在服用不用劑量鄭氏三七散和對(duì)照組的大鼠腎臟上。綜上所述,大鼠在實(shí)驗(yàn)期間服用不同劑量的鄭氏三七散對(duì)腎組織細(xì)胞無破壞作用,由此證明鄭氏三七散的毒性對(duì)大鼠腎臟沒有明顯的影響。

肌酐(Cr)是肌肉在活動(dòng)過程中代謝的產(chǎn)物,在臨床上,該指標(biāo)用于作為了解腎功能好壞的主要指標(biāo)之一。血清中肌酐濃度變化主要受到腎小球的濾過能力的影響,該能力下降,則會(huì)引起肌酐的濃度上升,該指標(biāo)如果高出正常值的范圍,則意味著腎臟受到了傷害。血液中肌酐高會(huì)導(dǎo)致一系列的不良現(xiàn)象:會(huì)導(dǎo)致鈉、鉀代謝失調(diào),具體的表現(xiàn)是高肌酐常常會(huì)伴隨著高或者低鈉或鉀血癥狀,會(huì)產(chǎn)生水代謝失調(diào),其具體表現(xiàn)在尿量增多,口渴,血壓升高等,還會(huì)使得循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等發(fā)生病變。在本實(shí)驗(yàn)中,服用不同劑量的鄭氏三七散的大鼠,其血液中肌酐的值隨著劑量的增加略有上升,不過都低于對(duì)照組,在統(tǒng)計(jì)上沒有顯著性的意義,其原因可能是鄭氏三七散中含有可使肌酐降低的藥物,由該指標(biāo)可知,不同劑量的鄭氏三七散對(duì)用于評(píng)價(jià)腎臟指標(biāo)的肌酐來說,具有有利于腎臟保護(hù)的作用。血尿素氮(BUN)是蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物。該指標(biāo)在臨床上和肌酐一起用于對(duì)腎臟功能的評(píng)價(jià)。該指標(biāo)增加,可以作為診斷慢性腎衰竭的指標(biāo),臨床上患者出現(xiàn)的癥狀有嚴(yán)重脫水,出現(xiàn)大量腹水,伴隨著心臟循環(huán)功能的紊亂。在臨床上出現(xiàn)的各種腎功能方面的實(shí)質(zhì)性病變,例如急慢性腎功能衰竭、間質(zhì)性腎炎、腎小球腎炎、腎內(nèi)占位性或者破壞性腎臟功能病變均可導(dǎo)致血液中的尿素氮含量濃度增高。在本實(shí)驗(yàn)中,服用不同劑量的鄭氏三七散大鼠的血尿素氮的含量大致相同,在8.5mmol/L左右,且均低于空白對(duì)照組的9.5mmol/L。但均在正常范圍內(nèi),可以認(rèn)為服用不同劑量鄭氏三七散對(duì)大鼠的腎功能影響無副作用,其藥理毒性甚低。

4 結(jié)論

(1)服用不同劑量鄭氏三七散與對(duì)照組大鼠的外觀形態(tài)和行為活動(dòng)表現(xiàn)正常,無異?,F(xiàn)象出現(xiàn),且各組大鼠的體重增加相似,可認(rèn)為服用不同劑量的鄭氏三七散對(duì)大鼠的生長沒有不良反應(yīng)。

(2)服用不同劑量的鄭氏三七散與對(duì)照組相比較,血肌酐和尿素氮等血液指標(biāo)無明顯差別,本研究認(rèn)為鄭氏三七散的腎毒性甚低。

(3)服用不同劑量的鄭氏三七散的大鼠,其腎單位結(jié)構(gòu)完整,未見水腫、萎縮等異常,腎細(xì)胞未見變性及壞死,各種現(xiàn)象表明鄭氏三七散對(duì)腎組織細(xì)胞無破壞作用,該藥使用安全,無副作用,適合臨床使用。

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