張 強, 劉繼剛, 劉 江, 劉 昊

(1. 華北理工大學附屬醫(yī)院, 河北 唐山 063000; 2. 遵化市人民醫(yī)院口腔科, 河北 遵化064200) 3. 華北理工大學基礎醫(yī)學院, 河北 唐山 063000)

Bcl- 2及DPC4在牙齦癌中的表達及相關性研究

張 強1, 劉繼剛2, 劉 江3, 劉 昊1

(1. 華北理工大學附屬醫(yī)院, 河北 唐山 063000; 2. 遵化市人民醫(yī)院口腔科, 河北 遵化064200) 3. 華北理工大學基礎醫(yī)學院, 河北 唐山 063000)

目的: 觀察Bcl- 2、DPC4蛋白在不同分化類型牙齦癌中的表達情況。方法：取手術切除的牙齦癌組織石蠟標本33例(其中高分化15例、中分化10例、低分化8例)，以及術中隨機從癌旁切除的正常牙齦組織石蠟標本8例為檢測對象；分別制備組織切片后，免疫組化技術檢測各標本組織中Bcl- 2、DPC4蛋白的表達情況。結果：①在正常牙齦組織以及高、中、低分化的牙齦癌組織中，Bcl- 2蛋白的陽性表達率(%)分別為12.50、53.33、60.00、100，DPC4蛋白的陽性表達率(%)分別為87.25、53.33、50.00、12.50(P<0.05)；②在正常牙齦組織以及高、中、低分化牙齦癌組織中，Bcl- 2蛋白的表達水平(IOD值)分別為1.86±0.33、4.55±1.23、9.60±0.92、13.92±1.84(P<0.05)，DPC4蛋白的表達水平分別為19.64±0.72、13.47±1.20、9.33±1.00、2.42±0.72(P<0.05)；③Bcl- 2、DPC4蛋白表達變化在牙齦癌中呈負相關(r=-0.929,P<0.05)。結論：牙齦癌組織中Bcl- 2蛋白表達增高，DPC4蛋白表達降低，二者具有相關性。

B淋巴細胞瘤-2基因; 胰腺癌缺失基因; 牙齦癌; 免疫組織化學

[DOI] 10.15956/j.cnki.chin.j.conserv.dent.2015.10.002

[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 2015, 25(10): 584]

牙齦癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，有較高的發(fā)病率、轉移率和復發(fā)率，且絕大多數為高分化的鱗狀上皮細胞癌[1-2]。研究與牙齦癌發(fā)生、轉移、預后相關的生物學指標將有助于綜合性方法的合理應用，以提高患者的生存率及生存質量。牙齦癌是多因素、多基因、多階段共同作用的結果，主要包括多種癌變基因的激活及抑癌基因的失活、缺失。Bcl- 2是一種從濾泡型B細胞淋巴瘤中分離出來的基因，其主要功能與細胞的程序性凋亡有關，是凋亡調控基因之一[3-4]。DPC4(deleted in pancreatic cancer4, DCP4)是在胰腺癌中發(fā)現的一種新型腫瘤抑制基因，其主要功能為調節(jié)細胞的生長、分化和凋亡[5]。本實驗旨在觀察Bcl- 2蛋白和DPC4蛋白在不同類型牙齦癌中的表達、分布及變化情況，并進一步分析兩者與牙齦癌分化程度的關系, 以期為臨床早期診斷及制定合理的治療方案提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

牙齦癌組織石蠟標本來自華北理工大學附屬醫(yī)院口腔頜面外科，共33例，其中高分化15例、中分化10例、低分化8例；正常牙齦組織石蠟標本8例，為手術中隨機從癌旁切取的正常牙齦組織；鼠抗DPC4多克隆抗體、兔抗Bcl- 2多克隆抗體(武漢博士德)；免疫組化試劑盒(北京中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法

分別取上述33例牙齦癌及8例正常牙齦組織石蠟標本，常規(guī)制備組織切片后，進行免疫組化染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用30 mL/L過氧化氫液室溫下封閉其內源性過氧化物酶活性后，分別進行抗原熱修復和50 g/L BSA封閉；然后分別滴加DPC4和Bcl- 2一抗(濃度均為1 ∶150)并4 ℃孵育過夜；生物素化標記IgG并37 ℃孵育20 min后，DAB顯色、常規(guī)封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 結果判定及定量分析

在高倍鏡(×400)下分別從每張切片中各選取5個不同視野進行觀察，并按以下標準判定染色陽性結果：Bcl- 2以細胞胞漿內出現棕黃色顆粒為陽性表達；DPC4以細胞胞漿和(或)細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性表達。根據空白和陽性對照的顯色情況，確定無假陽性和假陰性后，用 Image-Pro- plus 6.0圖像分析軟件系統(tǒng)對各切片陽性細胞表達的光密度進行定量分析，并以其積分光密度(IOD)代表染色強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組Bcl- 2、DPC4的陽性表達情況

免疫組化染色結果顯示：Bcl- 2主要表達于細胞漿內和細胞膜上，呈棕黃色著色(圖1a～d)；DPC4主要表達于細胞漿和細胞核內，呈棕黃色、彌散分布(圖1e～h)。Bcl- 2、DPC4在正常牙齦組織和不同分化程度牙齦癌組織中的陽性表達率見表1：其中Bcl- 2在正常牙齦組織中的陽性表達率最低(12.50%)，與正常組相比，其在牙齦癌組織中的陽性表達率則明顯升高，且隨著分化程度的降低而越來越高，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DPC4在正常牙齦組織中的陽性表達率最高(87.50%)，與正常組相比，其在牙齦癌組織中的陽性表達率則明顯降低，且隨著分化程度的降低而越來越低，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 Bcl- 2、DPC4在正常牙齦和不同分化 牙齦癌組織中的陽性表達率比較 (例, %)

不同字母組間P<0.05

正常牙齦組織 高分化牙齦癌組織 中分化牙齦癌組織 低分化牙齦癌組織

圖1 Bcl- 2和DPC4免疫組化染色結果(SABC，×400)

2.2 各組Bcl- 2和DPC4表達水平(IOD)的比較

Bcl- 2在正常牙齦組織的IOD值表達量最低; 與正常牙齦組織相比，其在牙齦癌組織中的IOD值表達量明顯增高，且隨著分化程度降低而越來越高，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。DPC4在正常牙齦組織中的IOD值表達量最高; 與正常牙齦組織相比，其在牙齦癌組織中的表達量明顯降低，且隨著分化程度的降低而越來越低，各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。相關性分析結果顯示，Bcl- 2和DPC4在不同分化類型牙齦癌中的表達呈明顯負相關(r=-0.929，P<0.05)。

表2 各組Bcl- 2和DPC4表達水平(IOD值)的比較

不同字母組間P<0.05

3 討論

牙齦癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤之一，目前仍以手術切除為主。但手術治療會造成患者顏面部的缺損和畸形，從而給患者的生理和心理帶來不利影響。因此研究與牙齦癌的發(fā)生、轉移、預后相關的生物學指標將有助于探討其新的綜合性治療方法。雖然有關腫瘤的分子生物學行為機制目前尚不清楚，但已知腫瘤組織內會由于細胞凋亡和增殖失衡而出現細胞凋亡的現象[6]。細胞凋亡是一種自穩(wěn)態(tài)機制，可通過抑制過度生長的細胞群體從而對腫瘤產生負作用。有研究表明，Bcl- 2蛋白產物在人體細胞中的表達量與細胞生存時間的長短有著密切關系[7]。DPC4編碼的Samad4蛋白是TGF- β信號傳導途徑的中心分子，而TGF- β則是一種具有調節(jié)細胞生長、增殖、分化、凋亡等多種生理功能的細胞因子，不僅能通過下調p53基因導致編碼蛋白的表達減少，同時還能抑制細胞生長周期過渡到G1/S期，并引發(fā)細胞DNA損傷，從而導致細胞凋亡[8]。目前關于Bcl- 2和DPC4在牙齦癌中的表達及其與牙齦癌的關系尚未見相關研究報道。

本結果顯示，在正常牙齦組織中，Bcl- 2的表達較低，而DPC4的表達則較高。在牙齦癌組織中，Bcl- 2的表達較正常組明顯增高，且隨著分化程度的降低而越來越高；而DPC4的表達則較正常組明顯降低，且隨著分化程度的降低而越來越低。以上結果表明，牙齦癌的惡性程度越高，Bcl- 2的表達越高，而DPC4的表達則越低。相關性分析結果顯示，Bcl- 2和DPC4在不同分化類型牙齦癌中的表達呈明顯負相關；提示，兩者在牙齦癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用。

綜上所述，DPC4基因在牙齦癌中的表達明顯減少，而Bcl- 2的表達則明顯增高，說明兩者在牙齦癌的發(fā)生、發(fā)展中均起著重要作用，有可能成為牙齦癌的診斷、分型、治療以及愈后判斷的指標之一。

[1]張詮. 116例牙齦癌的治療與預后分析[J]. 癌癥, 2008, 27(3): 307-310.

[2]柳楊. 口腔白斑中抑癌基因啟動子高甲基化的研究[D]. 上海: 上海交通大學, 2011.

[3]林良緣, 高洋, 柯學平, 等. 表皮生長因子受體與口腔白斑癌變關系的初步研究[J]. 口腔醫(yī)學, 2010, 30(4): 199-201.

[4]張素欣. PTEN在口腔鱗狀細胞癌中的定量分析及平陽霉素化療對其表達的影響[J]. 現代口腔醫(yī)學雜志, 2006, 20(1): 9-10.

[5]Hahn SA, Schutte M, Hoque AT,etal. DPC4, a candidate tumor suppress or gene at human chromosome 18q21.1[J].Science, 1996, 271(5247):350-353.

[6]Daniel FI, Rivero ER, Modolo F,etal. Immunohistochemical expression of DNA methyltransferases 1, 3a and 3b in oral leukoplakias and squamous cell carcinomas[J].ArchOralBiol, 2010, 55(12): 1024-1030.

[7]Ortholan C, Lusinchi A, Italiano A,etal. Oral cavity squamous cell carcinoma in 260 patients aged 80years or more[J].Radiotheroncol, 2009, 93(3): 516-523.

[8]Krishnan MMR, Chakraborty C, Paul RR,etal. Hybrid segmentation, characterization and classification of basal cell nuclei from histopathological images of normal oral mucosa and oral submucous fibrosis[J].ExpertSystemswithApplication, 2012, 39(1): 1062-1077.

Expression and relationship of Bcl-2 and DPC4 in Gingival Cancer

ZHANG Qiang*, LIU Ji- gang, LIU Jiang, LIU Hao

(*DepartmentofDentistry,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofSciencesandTechnology,Tangshan063000,China)

AIM: To investigate the expression of Bcl- 2 and DPC4 in gingival cancer tissues . METHODS: 33 paraffin specimens of gingival cancer tissues (15 well- differentiated,10 moderately differentiated and 8 poorly differentiated) and 8 cases of normal gingival tissues were examined. The expression of Bcl- 2 and DPC4 in the samples was detected by immunohistochemistry method. RESULTS：Positive expression rates of Bcl- 2 in normal gingival tissue, well-, moderately- and poorly- differentiated gingival cancer tissues were 12.50%, 53.33%, 60.00% and 100% respectively(P<0.05); while positive DPC4 expression rates were 87.25%, 53.33%, 50.00% and 12.50% respectively(P<0.05). The IOD value of Bcl- 2 in normal gingival tissue, well-, moderately- and poorly- differentiated gingival cancer tissues were 1.84±0.33, 4.55±1.23, 9.60±0.92 and 13.92±1.84 respectively(P<0.05); whereas, the IOD value of DPC4 were 19.64±0.72, 13.47±1.20, 9.33±1.00 and 2.42±0.72 respectively(P<0.05). Bcl- 2 and DPC4 expressions in gingival cancer tissues were negatively correlated(r=-0.929，P<0.05). CONCLUSION: In gingival cancer tissues, Bcl- 2 expression increases, while DPC4 expression decreases. The expression of Bcl- 2 and DPC4 is negatively related.

Bcell lymphoma- 2 (Bcl- 2) ; deleted in pancreatic cancer 4 (DPC- 4); gingival cancer; immunohistochemistry

2015-07-06

國家自然科學基金(81201048)

張 強(1975-)，男，漢族，河北唐山人。碩士，副主任醫(yī)師

劉 昊, E-mail：liuhao938@163.com

R780.2

A

1005-2593(2015)10-0584-04

河北省醫(yī)學科學研究重點課題(20150087)