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乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值

2015-11-25 11:06:53魏留柱內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市臨河市人民醫(yī)院免疫科內(nèi)蒙古臨河051000
關(guān)鍵詞:重復(fù)性核酸乙型肝炎

魏留柱 (內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市臨河市人民醫(yī)院免疫科,內(nèi)蒙古 臨河051000)

乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值

魏留柱 (內(nèi)蒙古自治區(qū)巴彥淖爾市臨河市人民醫(yī)院免疫科,內(nèi)蒙古 臨河051000)

目的:探討實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(FQ-PCR)檢測(cè)乙型肝炎病毒 DNA在臨床診斷中的價(jià)值.方法:對(duì)我院收治的190例乙型肝炎病毒感染患者的血清提取 DNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清中HBV-DNA,ELISA法測(cè)定 HBV血清標(biāo)記物.結(jié)果:FQ-PCR檢測(cè)的靈敏度和重復(fù)性良好,111例HBeAg(+)/HBeAb(-)標(biāo)本中FQ-PCR均呈陽性,HBV-DNA拷貝數(shù)1.04×107/mL,67例HBeAg(-)/HBeAb(+)標(biāo)本中,陽性率為58.2%,12例HBeAg(-)/HBeAb(-)標(biāo)本中,陽性率為33.3%.結(jié)論:實(shí)時(shí)熒光定量 PCR可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測(cè)HBV-DNA,可使診斷更準(zhǔn)確,治療更合理.

乙型肝炎病毒;熒光定量 PCR;免疫測(cè)定

0 引言

乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的肝臟炎性病變,可引起多器官損害.該病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的世界性傳染疾病,屬于散發(fā)性疾病,一年四季均可發(fā)病,近年來發(fā)病趨勢(shì)一直上升[1].實(shí)時(shí)熒光定量 PCR實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍,是檢測(cè)乙肝病毒血癥最敏感的方法,與常規(guī) PCR相比,具有特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于臨床疾病診斷[2].本文對(duì) 190例乙型肝炎病毒核酸采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法檢測(cè),并與乙肝病毒標(biāo)志不同模式進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果如下.

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取我院 2013-06/2014-03傳染病科接診的 190例乙型肝炎病毒感染患者血清提取DNA,其中男123例,女67例,平均年齡34±5歲.

1.2 試劑與方法 采用 ELISA法檢測(cè) HBV免疫標(biāo)志物,匹基盒由上海信??萍加邢薰咎峁瑖?yán)格按照匹基盒說明書操作,采用酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果判斷[3].

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)HBV-DNA,嚴(yán)格按照匹基盒說明書進(jìn)行操作,按照常規(guī)方法提取患者血清 HBV-DNA.具體操作為:取待測(cè)血清樣本和匹基盒中對(duì)照品各100 μL,10 000 r/min離心10 min;取上清液,加入100 μL DNA提取液 I,震蕩搖勻后,10 000 r/min離心10 min;棄上清,沉淀物中再加入25 μL DNA提取液 II,震蕩混勻,沸水浴 10 min,10 000 r/min離心10 min,取上清液備用[4].取37.6 μL PCR反應(yīng)液加入0.2 mL離心管中,再加 0.4 μL Taq酶及0.06 μL尿苷酶作為反應(yīng)管,加入 2 mL處理樣本和對(duì)照品,設(shè)置對(duì)照品濃度梯度為 108,107,106,105,104,103copies/mL.

混勻后轉(zhuǎn)移至檢測(cè)區(qū),采用核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增,條件為:93℃預(yù)變性 2 s,94℃預(yù)變性 5 s,60℃預(yù)變性30 s,共40個(gè)循環(huán),引物和探針由上海生工生物工程公司合成(表 1)[5].

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 STATA7.0統(tǒng)計(jì)分析軟件直線相關(guān)和回歸分析,對(duì)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 PCR的靈敏度和重復(fù)性 將對(duì)照品 10倍稀釋,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定,結(jié)果見圖1,以對(duì)數(shù)濃度為橫坐標(biāo),循環(huán)次數(shù)為縱坐標(biāo),具有良好的線性關(guān)系.將系列稀釋的對(duì)照品用熒光定量 PCR測(cè)定10次,每管重復(fù)3次,重復(fù)性結(jié)果見表2,表明PCR重復(fù)性良好.

表1 PCR所用引物和探針

圖1 HBV DNA的FQ-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 FQ-PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)性

2.2 FQ-PCR檢測(cè)血清 HBV-DNA結(jié)果 血清HBV-DNA與 HBV標(biāo)記物 FQ-PCR檢測(cè)的結(jié)果見表3.

表3 HBV-DNA與HBV標(biāo)記物FQ-PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn),急慢性肝炎的主要致病因子是乙型肝炎病毒(HBV),該病毒是一種 DNA病毒,對(duì)人和猩猩有易感性,引發(fā)乙型病毒性肝炎疾?。覈?億人感染乙型肝炎病毒,且每年都呈增長(zhǎng)趨勢(shì),臨床資料顯示部分乙肝患者能夠形成持久免疫力,清除體內(nèi)乙肝病毒,形成慢性感染患者,大多患者逐步演化為肝硬化,甚至肝癌.目前臨床診斷 HBV感染最敏感的方法是 PCR技術(shù),能夠準(zhǔn)確反映感染情況,縮短感染后的窗口期,PCR擴(kuò)增技術(shù)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)一些血清學(xué)指標(biāo)陰性的突變株DNA[6].本文研究結(jié)果表明,實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HBV-DNA具有較高的靈敏性和良好的重復(fù)性.ELISA方法檢測(cè) HBV血清是診斷 HBV感染的標(biāo)志性方法,具有高靈敏性和準(zhǔn)確性,可以間接反映 HBV的表達(dá)和復(fù)制,臨床檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),血清HBeAg陽性是HBV復(fù)制活躍、傳染性強(qiáng)的標(biāo)志.本文研究結(jié)果表明,HBeAg陽性患者血清HBV-DNA陽性率及含量顯著高于其它患者(P<0.005),HBeAg(+)系統(tǒng)與HBeAg(-)系統(tǒng)比較,差異有顯著(P<0.005).綜上所述,ELISA法結(jié)合FQ-PCR技術(shù)能夠準(zhǔn)確研究 HBV感染的自然進(jìn)程,監(jiān)測(cè)患者對(duì)抗病毒治療的反應(yīng),對(duì) HBV感染的診斷、療效判定等有重要的指導(dǎo)意義.

[1]韓俊英,曾瑞萍.熒光定量 PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué):遺傳學(xué)分冊(cè),2000,23(3):117-120.

[2]蔡葉琴,孫 彥,黃 黎.血清HBV-DNA與HBV免疫學(xué)標(biāo)志物之間的相關(guān)性研究[J].河北醫(yī)學(xué),2011,17(2):153-155.

[3]黃四爽,熊 勤.乙型肝炎病毒核酸實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值[J].?dāng)?shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志,2012,25(4):484-485.

[4]陳素玲,胡國齡,譚德明.381例HBV感染者 HBV DNA前 C區(qū)基因突變的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2001,11(8):48-50.

[5]Pas SD,F(xiàn)ries E,De Man RA,et al.Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays[J].J Clin Microbiol,2000,38(8):2897-2901.

[6]周 丹.乙型肝炎病毒DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)在臨床診斷中的價(jià)值[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(20):2271-2272.

The value of real-time fluorescence quantitative PCR in clinical diagnosis of HBV DNA

WEI Liu-Zhu
Department of Immunology,Linhe People's Hospital,Linhe 051000,China

AIM:To explore the value of the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR)in clinical detecting heptitis B virus(HBV)DNA.METHODS:The sera from 190 patients were measured by FQ-PCR,and the plasma markers were detected by ELISA.RESULTS:The detection sensitivity and reproducibility of FQ-PCR are excellent.There were 111 patients that the FQ-PCR results of HBeAg(+)/HBe-Ab(-)samples were positive,with 1.04×107/mL of HBVDNA copy on the average.In the 67 patients'HBeAg(-)/HBe-Ab(+)samples,the positive rate was 58.2%.In the 12 patients'HBeAg(-)/HBeAb(-)samples,the positive rate was 33.3%.CONCLUSION:FQ-PCR can ensure the accurate and quantitative HBV-DNA detection,accurate diagnosis and reasonable treatment.

HBV;fluorescence quantitative PCR;immunoassay

R512.6+2

A

2095-6894(2015)01-134-02

2014-11-18;接受日期:2014-12-04

魏留柱.大專,主管檢驗(yàn)師.研究方向:臨床檢驗(yàn).Tel:0478-8295982 E-mail:weifanchengw@163.com

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