徐峰，劉舒云，彭江，盧世璧，孫遜，尹合勇，孫振，余曉明，肖波，張金鑫，袁玫，許文靜，郭全義

·論著·

血管周圍干細(xì)胞在大鼠脂肪組織中的含量及其體外擴(kuò)增后比例的變化

徐峰，劉舒云，彭江，盧世璧，孫遜，尹合勇，孫振，余曉明，肖波，張金鑫，袁玫，許文靜，郭全義

目的 探索大鼠脂肪組織中血管周圍干細(xì)胞（PSCs）在脂肪組織細(xì)胞中所占的比例，以及體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）中 PSCs比例的變化，為組織工程自體細(xì)胞移植修復(fù)骨和軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究提供可能的新型種子細(xì)胞。

方法 取大鼠的脂肪組織用 II型膠原酶消化得到血管基質(zhì)成分（SVF）并且體外培養(yǎng)擴(kuò)增大鼠ADSCs至 P3代，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及流式細(xì)胞儀檢測(cè) SVF細(xì)胞密度、活細(xì)胞比例、PSCs含量，檢測(cè) ADSCs中PSCs的含量并與CD45–SVF細(xì)胞中 PSCs含量進(jìn)行比較。

結(jié)果 經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分析，每只大鼠約 3 ml脂肪組織消化所得 SVF中活細(xì)胞比例為（69.31±6.57）%，可收獲活細(xì)胞（40.69±6.81）×106個(gè)。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每只 SD大鼠 3 ml脂肪組織中平均可以得到 PSCs活細(xì)胞為（1.60± 0.59）×106個(gè)，血管外周細(xì)胞為（0.18±0.04）×106個(gè)，血管外膜細(xì)胞為（1.42±0.57）×106個(gè)。而體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增的 P3代ADSCs中，PSCs及各細(xì)胞亞群的比例并沒(méi)有隨著細(xì)胞的擴(kuò)增而改變（P＞0.05）。

結(jié)論 大鼠脂肪組織中含有 PSCs，可以直接通過(guò)流式分選獲取大量 PSCs，不進(jìn)行體外擴(kuò)增即可望滿足骨和軟骨組織工程種子細(xì)胞的需要。

血管周圍干細(xì)胞； 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞； 流式細(xì)胞術(shù)

目前，血管周圍干細(xì)胞（perivascular stem cells，PSCs）成為種子細(xì)胞新的研究熱點(diǎn)［1］，其在骨組織工程研究中對(duì)骨缺損的良好修復(fù)能力已經(jīng)得到了證實(shí)［2-3］，血管外周細(xì)胞（pericytes）體外研究證實(shí)亦有較強(qiáng)成軟骨能力［4］，可以大量分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF-BB）等生長(zhǎng)因子［5］，是一種嶄新的、具有潛力的組織工程種子細(xì)胞。血管周圍干細(xì)胞位于大、中、小以及毛細(xì)血管周圍，被認(rèn)為是一種未分化的純凈的間充質(zhì)干細(xì)胞［3］。PSCs包括兩個(gè)干細(xì)胞亞群［2-3］，分別為位于毛細(xì)血管等最小血管周圍的血管外周細(xì)胞和存在于較大血管周圍的血管外膜細(xì)胞（adventitial cells）。血管外周細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記為 CD146+、CD45–、CD34–；血管外膜細(xì)胞的表面標(biāo)記為 CD146–、CD45–、CD34+。Crisan等［1］發(fā)現(xiàn)在人的肌肉、脂肪、骨髓、腎臟、胰腺、肝臟、胎盤(pán)、心臟、皮膚、肺、腦、腸、眼睛、臍帶組織中均有血管外周細(xì)胞的存在，而其他物種體內(nèi)是否存在血管周圍干細(xì)胞PSCs卻少見(jiàn)報(bào)道。而大鼠作為骨和軟骨組織工程研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其體內(nèi)是否存在血管周圍干細(xì)胞 PSCs尚未見(jiàn)報(bào)道。所以本研究旨在探索大鼠脂肪組織中是否存在血管周圍干細(xì)胞 PSCs和其在脂肪組織細(xì)胞中所占的比例，以及探索在平面培養(yǎng)擴(kuò)增的大鼠脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 ADSCs中血管周圍干細(xì)胞 PSCs所占的比例的變化情況，為組織工程自體細(xì)胞移植修復(fù)骨和軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 I型膠原酶、II型膠原酶為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；DMEM、PBS液、培養(yǎng)皿、50 ml離心管、25 cm2培養(yǎng)瓶、75 cm2培養(yǎng)瓶、胰蛋白酶均為美國(guó) Corning公司產(chǎn)品；胎牛血清為北京元亨圣馬生物技術(shù)公司產(chǎn)品；雙抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；CD146-APC熒光標(biāo)記流式抗體購(gòu)自美國(guó) R&D公司；CD34-PE-Cy7熒光標(biāo)記流式抗體購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz公司；CD45-PE熒光標(biāo)記流式抗體、CD90-PE熒光標(biāo)記流式抗體、血細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó) BD公司；CD29-PE熒光標(biāo)記流式抗體、CD44H-PE熒光標(biāo)記流式抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠 16只，4周齡，雄性，由解放軍總醫(yī)院動(dòng)物中心提供；SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 70目濾網(wǎng)、流式管、流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) BD公司；磁力攪拌器購(gòu)自德國(guó) IKA公司；Cellometer Auto T4全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分離 SD 大鼠脂肪組織血管基質(zhì)成分SVF 取16只 4周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分成8批，每批 2只，脫頸處死后常規(guī)備皮，于 75% 酒精中浸泡消毒 15 min，無(wú)菌操作下取每只大鼠雙側(cè)腹股溝處脂肪置于培養(yǎng)皿中，每批 2只大鼠可得脂肪組織約 6 ml，將得到的脂肪組織用 PBS液反復(fù)沖洗 3遍，用眼科剪充分剪碎后轉(zhuǎn)移入無(wú)菌小玻璃瓶中，加入用DMEM配制好的無(wú)菌的1 mg/ml II型膠原酶 20～30 ml，再放入磁力攪拌器轉(zhuǎn)子，在 37℃ 恒溫箱中，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速以 120 r/min于磁力攪拌器上消化 45 min。將所得液體轉(zhuǎn)入 50 ml離心管中，以 1800 r/min速度離心 5 min去除上層液體，將下層的細(xì)胞沉淀加入 5 ml血細(xì)胞裂解液重新吹打懸浮，于室溫中靜置 10 min后以1800 r/min速度離心，棄上清，加入大量 PBS液和沉淀混勻，用 70 μl濾網(wǎng)過(guò)濾后得到單細(xì)胞懸液，用 PBS液洗滌 3遍后，加入 1 ml PBS液重新懸浮即得到脂肪組織血管基質(zhì)成分 SVF。

1.2.2 全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活細(xì)胞比例分析 取每批所得血管基質(zhì)成分 SVF 20 μl液體用臺(tái)盼藍(lán)染色，用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀按照說(shuō)明書(shū)操作分別進(jìn)行細(xì)胞密度、活細(xì)胞比例分析。

1.2.3 SD大鼠脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 ADSCs的平面培養(yǎng)和傳代 取每批脂肪組織所得一半的SVF，以 1800 r/min速度離心 5 min，棄上清，將下層細(xì)胞沉淀加入適量含 10%胎牛血清、1%雙抗的 DMEM重新吹打懸浮細(xì)胞后接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶中。于 5%CO237℃ 恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于 24 h后進(jìn)行首次半量換液，以后每 3天換一次液。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到 80%時(shí)傳代，用 PBS液沖洗 3遍，胰蛋白酶消化細(xì)胞后用含 10% 胎牛血清的 DMEM終止消化，按 1∶3比例傳代，直至傳到 P3代，胰蛋白酶消化后用含 10%胎牛血清的 DMEM終止消化，以 1800 r/min速度離心5 min，棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后加入適量 PBS液重新吹打懸浮，制備成 1×107個(gè)/ml單細(xì)胞懸液待用。

1.2.4 用流式細(xì)胞儀鑒定 SD大鼠脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 ADSCs取第一批 ADSCs單細(xì)胞懸液，分別吸取 100 μl液體加入 5只流式管中，一只為陰性對(duì)照，其余 4只分別加入 CD90-PE、CD29-PE、CD44H-PE和 CD45-PE熒光抗體，室溫下于暗室中孵育 15 min，再加入 PBS液洗滌，于 1800 r/min離心 5 min后小心去除上清液，加入 PBS液重新吹打懸浮為單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 用流式細(xì)胞儀分析鑒定血管外周細(xì)胞、血管外膜細(xì)胞以及血管周圍干細(xì)胞的比例 將 8批脂肪組織所得 SVF和所得 8批 P3代 ADSCs單細(xì)胞懸液分別加入流式管中，再分別加入CD146-APC、CD34-PE-Cy7和 CD45-PE熒光抗體，于室溫下在暗室中孵育 15 min，再加入 PBS液后混勻，以 1800 r/min速度離心 5 min，去除上清液，加入 PBS液吹打懸浮為單細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其中血管外周細(xì)胞（CD146+、CD45–、CD34–）、血管外膜細(xì)胞（CD146–、CD45–、CD34+）和血管周圍干細(xì)胞 PSCs（以上兩者之和）的比例。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算每只大鼠所得 3 ml脂肪組織所含 PSCs活細(xì)胞數(shù)、所得 SVF中 PSCs所含比例，以及比較 CD45–SVF細(xì)胞和 P3代ADSCs中PSCs和各細(xì)胞亞群的含量差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件 SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。正態(tài)分布的連續(xù)變量以± s 描述，兩組間的比較采用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的連續(xù)變量以 M（Q1～Q3）描述，組間比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組脂肪組織消化所得 SVF細(xì)胞密度和活細(xì)胞比例

用全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：每只大鼠 3 ml脂肪組織所得 SVF中細(xì)胞密度平均為（118.14±20.53）×106個(gè)/ml，其中活細(xì)胞比例為（69.31±6.57）%，所以每只大鼠 3 ml脂肪組織消化后所得 SVF中的總細(xì)胞數(shù)平均為（59.07±10.26）×106個(gè)，其中活細(xì)胞數(shù)平均為（40.69±6.81）×106個(gè)。

2.2 SD大鼠 ADSCs的平面培養(yǎng)及鑒定

細(xì)胞培養(yǎng) 1 d首次換液后倒置顯微鏡下觀察，鏡下見(jiàn)細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形、多角形或短梭形，大小不一，有的呈簇樣分布（圖 1A）。3～5 d細(xì)胞融合達(dá) 80% 之后以 1∶3傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，2～3 d融合可達(dá) 80%。直至細(xì)胞傳到P3代后純化，細(xì)胞形態(tài)均一，趨于長(zhǎng)梭形（圖 1B），多角形和圓形細(xì)胞少見(jiàn)。

用流式細(xì)胞儀檢測(cè) P3代 ADSCs細(xì)胞表型（圖 2）：CD90陽(yáng)性率達(dá) 94.02%（圖 2A），CD29陽(yáng)性率達(dá) 99.51%（圖 2B），CD44陽(yáng)性率達(dá) 94.02%（圖 2C），CD45表達(dá)陰性 94.41%（圖 2D），可鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞表型符合ADSCs特征，確實(shí)為ADSCs。

圖1 ADSCs倒置顯微鏡下圖像（×100）（A：P0代；B：P3代）Figure 1 ADSCs image observed with inverted microscope （×100）（A:P0；B:P3）

圖2 P3代ADSCs流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)（A：CD90+細(xì)胞為 94.02%；B：CD29+細(xì)胞為 99.51%；C：CD44+細(xì)胞為 94.02%；D：CD45–細(xì)胞為 94.41%）Figure 2 P3ADSCs detected by flow cytometry（A:Cells of CD90+are 94.02%；B:Cells of CD29+are 99.51%；C:Cells of CD44+are 94.02%；D:Cells of CD45–are 94.41%）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) PSCs比例（A：SVF中 CD45–細(xì)胞比例為 24.56%；B：血管外周細(xì)胞占 CD45–SVF細(xì)胞的比例為 2.65%，血管外膜細(xì)胞占 CD45–SVF細(xì)胞的比例為 5.77%；C：P3代 ADSCs中 CD45–細(xì)胞的比例為 94.41%；D：血管外周細(xì)胞占 CD45–ADSCs的比例為 2.53%，血管外膜細(xì)胞占 CD45–ADSCs比例為 14.38%）Figure 3 The proportion of PSCs tested by flow cytometry（A:Proportion of CD45–cells in SVF is 24.56%；B:Proportion of pericytes in CD45–SVF cells is 2.65%，the proportion of adventitial cells in CD45–SVF cells is 5.77%；C:Proportion of CD45–cells in ADSCs is 94.41%；D:Proportion of pericytes in CD45–ADSCs cells is 2.53%，the proportion of adventitial cells in CD45–ADSCs cells is 14.38%）

2.3 血管外周細(xì)胞、血管外膜細(xì)胞以及血管周圍干細(xì)胞 PSCs的比例

用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè) 8批 SVF和 P3代ADSCs中 PSCs的含量（圖 3），經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后可知：每只 SD大鼠 3 ml脂肪組織消化所得 SVF 中 CD45–細(xì)胞比例平均為（27.00±7.16）%，血管外周細(xì)胞所占比例平均為（0.67±0.19）%，血管外膜細(xì)胞所占比例平均為（5.37±2.51）%，血管周圍干細(xì)胞 PSCs（即兩者之和）所占比例平均為（6.04±2.64）%，每只 SD大鼠 3 ml脂肪組織中平均含有 PSCs活細(xì)胞為（1.60±0.59）×106個(gè)，血管外周細(xì)胞為（0.18±0.04）×106個(gè)，血管外膜細(xì)胞為（1.42±0.57）×106個(gè)。在 CD45–的 SVF細(xì)胞中血管外周細(xì)胞所占比例平均為（2.51±0.46）%，血管外膜細(xì)胞所占比例平均為（19.98±8.21）%，PSCs所占比例平均為（22.49±8.43）%。SD大鼠P3代 ADSCs中 CD45–細(xì)胞比例平均為（95.30± 1.77）%，血管外周細(xì)胞所占比例平均為（2.22± 0.44）%，血管外膜細(xì)胞所占比例平均為（14.27± 2.74）%，PSCs所占比例平均為（15.74±2.95）%。但傳代培養(yǎng)擴(kuò)增后 ADSCs中各個(gè) PSCs亞群與直接消化后所得 CD45–SVF細(xì)胞中各個(gè) PSCs亞群相比并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明在體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增的 P3代 ADSCs中，PSCs及各細(xì)胞亞群的比例并沒(méi)有隨著細(xì)胞的擴(kuò)增而改變。

3 討論

種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子是組織工程的三要素，而種子細(xì)胞的選擇更是決定組織工程修復(fù)骨和軟骨損傷成敗的關(guān)鍵因素之一。目前，骨和軟骨組織工程實(shí)驗(yàn)研究中常用的種子細(xì)胞有同種異體骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 BMSCs［6］、同種異體脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞 ADSCs［7］以及軟骨細(xì)胞［8］。然而，這些異體的種子細(xì)胞雖然在修復(fù)中起到了一定的效果，但目前的干細(xì)胞培養(yǎng)方法無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)大量分離出純凈、均一的間充質(zhì)干細(xì)胞，且細(xì)胞在體外培養(yǎng)傳代的過(guò)程中明顯影響干細(xì)胞的基因變化［9］，從而影響增殖分化等功能，影響組織工程修復(fù)的效果。所以尋找一種純凈的、均一的容易大量獲取的自體來(lái)源的干細(xì)胞來(lái)作為組織工程修復(fù)骨和軟骨損傷的種子細(xì)胞成為新的研究方向。而用流式細(xì)胞分選術(shù)直接分選脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞可以短時(shí)間內(nèi)大量獲得種子細(xì)胞，且無(wú)需經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)擴(kuò)增，減少了風(fēng)險(xiǎn)，是目前獲取種子細(xì)胞的理想方法和研究熱點(diǎn)。

血管周圍干細(xì)胞 PSCs已被發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)廣泛存在，幾乎存在于人體每個(gè)器官的大、中、小和毛細(xì)血管周圍，尤其在脂肪組織中含量較高，可以達(dá)到 40% 左右［3］，適合經(jīng)過(guò)分選大量獲得。且PSCs被認(rèn)為是純凈的、均一的間充質(zhì)干細(xì)胞，其修復(fù)骨缺損效果已得到認(rèn)可，體外成軟骨能力較好［4］，是理想的骨和軟骨組織工程種子細(xì)胞。但其體內(nèi)對(duì)軟骨損傷的修復(fù)能力尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，而在以大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究中，尚需從大鼠脂肪組織中分離獲取 PSCs，然而大鼠脂肪中是否含有 PSCs以及其含量尚不清楚。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，每只 SD大鼠 3 ml脂肪組織中平均可獲得PSCs（1.60±0.59）×106個(gè)，可以通過(guò)流式細(xì)胞分選短期獲得足量細(xì)胞而不用經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期體外培養(yǎng)擴(kuò)增。因?yàn)榇笫蟾构蓽现窘M織中含有大量的淋巴細(xì)胞，造成 CD45–細(xì)胞比例不高。雖然 SD大鼠的脂肪組織中 PSCs含量較人脂肪組織中 PSCs含量少，只有（6.04±2.64）%，但大鼠脂肪組織中所含脂滴少于人抽脂術(shù)所得脂肪，且細(xì)胞體積小于人脂肪細(xì)胞，故相同體積脂肪組織中大鼠細(xì)胞數(shù)多于人的細(xì)胞數(shù)。雖然大鼠脂肪組織中所含 PSCs比例較低，但是絕對(duì)數(shù)目依然較多。

綜上所述，本研究表明大鼠脂肪組織中含有PSCs，雖然所含比例較人脂肪組織中少，但可以滿足以大鼠為模型進(jìn)行 PSCs為種子細(xì)胞的組織工程修復(fù)病損組織的研究。

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Methods Stromal vascular fraction（SVF）was isolated by collagenase type II digestion from the SD rat adipose tissue and ADSCs was cultured in vitro until P3.The cell density of SVF cells，the proportion of living cells and the proportion of PSCs in SVF were measured by the cell counter and flow cytometry（FCM）.The proportion of PSCs in ADSCs was compared with that in CD45–SVF cells.

Results The proportion of live cells in SVF isolated from each 3 ml of rat adipose tissue was（69.31±6.57）%，reaching（40.69± 6.81）×106cells.There were（1.60±0.59）×106of PSCs，（0.18±0.04）×106of pericytes and（1.42±0.57）×106of adventitial cells obtained from each 3 ml of rat adipose tissue by the flow cytometry sorting.In the in vitro cultured P3of ADSCs，the proportions of PSCs and cell subsets were not significantly changed（P＞0.05）.

Conclusion This research suggests that there are enough PSCs in the adipose tissue of rat and the content of PSCs from flow cytometric sorting in the tissue may meet the needs of seed cells for bone and cartilage tissue-engineering without in vitro culture.

Proportion of perivascular stem cells（PSCs）in adipose tissue of rat and the content changes of PSCs inADSCs

XU Feng，LIU Shu-yun，PENG Jiang，LU Shi-bi，SUN Xun，YIN He-yong，SUN Zhen，YU Xiao-ming，XIAO Bo，ZHANG Jin-xin，YUAN Mei，XU Wen-jing，GUO Quan-yi

Objective To explore the proportion of PSCs in adipose tissue cells of rat and the proportion changes of PSCs in ADSCs which were cultured in vitro.This research aims to provide potential new seed cells for autologous cell transplantation to repair the injuries of bone and cartilage in tissue-engineering.

Perivascular stem cells；Adipase derived stem cells；Flow cytometry

GUO Quan-yi，Email:doctorguo@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.001

國(guó)家自然科學(xué)基金（81472092）；國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863計(jì)劃）（2012AA020502）

100853北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所（徐峰、劉舒云、彭江、盧世璧、孫遜、尹合勇、孫振、余曉明、肖波、張金鑫、袁玫、許文靜、郭全義）；300071天津，南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院（孫遜、尹合勇）；154007黑龍江，佳木斯大學(xué)研究生院（張金鑫）

郭全義，Email：doctorguo@163.com

2014-12-24

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（2）:97-101

Author Affiliations:Orthopaedic Research Institute，General Hospital of People's Liberation Army，Beijing 100853，China（XU Feng，LIU Shu-yun，PENG Jiang，LU Shi-bi，SUN Xun，YIN He-yong，SUN Zhen，YU Xiao-ming，XIAO Bo，ZHANG Jin-xin，YUAN Mei，XU Wen-jing，GUO Quan-yi）；School of Medicine，Nankai University，Tianjin 300071，China（SUN Xun，YIN He-yong）；Graduate School，Jiamusi University，Heilongjiang 154003，China（ZHANG Jin-xin）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:97-101