張智慧，張晶，劉偉，陳云雨，司書(shū)毅，王艷宏

以PLK1 PBD為靶點(diǎn)的小分子抑制劑篩選及其抗癌活性研究

張智慧*，張晶*，劉偉，陳云雨，司書(shū)毅，王艷宏

目的 利用熒光偏振模型進(jìn)行 PLK1 PBD抑制劑的高通量篩選，并對(duì)陽(yáng)性化合 6143D7的抗癌效果進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。

方法 采用噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)初篩陽(yáng)性化合物對(duì)不同細(xì)胞系增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞周期以及凋亡率的影響；分子對(duì)接檢測(cè)化合物與 PLK1 PBD結(jié)構(gòu)域的親和性。

結(jié)果 利用熒光偏振模型得到的陽(yáng)性化合物 6143D7經(jīng)噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)顯示能抑制癌細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示該化合物加藥組 G2/M 期細(xì)胞比例高于對(duì)照組并能促進(jìn)細(xì)胞凋亡；分子對(duì)接結(jié)果表明化合物與 PLK1 PBD結(jié)構(gòu)域的親和性良好。

結(jié)論 該化合物通過(guò)抑制 PLK1 PBD結(jié)構(gòu)域的活性發(fā)揮抗癌作用，有望成為靶向 PLK1的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。

蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶； 藥物篩選試驗(yàn)，抗腫瘤； 熒光偏振； polo樣激酶 1抑制劑

激酶是調(diào)控正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增殖的主要蛋白，polo樣激酶（polo-like kinases，PLKs）是一類結(jié)構(gòu)和功能均高度保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶［1-2］，已經(jīng)報(bào)道的PLKs（PLK1、PLK2、PLK3、PLK4）在結(jié)構(gòu)方面具有很大的相似性，它們的 N端具有一個(gè)高度同源的激酶催化結(jié)構(gòu)域［3-4］，C端具有調(diào)節(jié) PLKs催化活性及亞細(xì)胞動(dòng)態(tài)定位的特征性結(jié)構(gòu)域（polo-box domain，PBD）［5］。PLK家族不同成員的 PBD對(duì)同一底物的親和力不同，PBD1有兩個(gè)特異的 polo-box（PB1和 PB2），PB1由 78個(gè)氨基酸組成，PB2序列也相差不大，而 PBD4為兩個(gè) PLK4聚合后的變異體，C端序列存在很大的特異性，且僅存在一個(gè) polo-box［6］。

PLK1主要在有絲分裂的 G2晚期和 M 期表達(dá)，參與有絲分裂的多個(gè)階段，在四種激酶中最為重要［7］，被公認(rèn)為是一個(gè)潛在的治療癌癥藥物的靶點(diǎn)［8-9］。然而，目前大部分抗 PLK1小分子抑制劑均是針對(duì)激酶結(jié)構(gòu)域的 ATP結(jié)合口袋（ATP-binding pocket）進(jìn)行設(shè)計(jì)的［10-11］，但 ATP結(jié)合區(qū)的結(jié)構(gòu)保守性使其對(duì)其他激酶的抑制作用難以區(qū)別，并且還容易與類似的藥物有交叉耐藥性。所以，為尋求更高效、專一的 PLK1抑制劑，PBD1成為了近年來(lái)尋找高選擇性 PLK1抑制劑的新靶點(diǎn)［12-19］。

熒光偏振方法是 Perrin［20］于 1926年提出的理論，通過(guò)檢測(cè)熒光標(biāo)記的分子或者固有熒光分子的熒光強(qiáng)弱變化來(lái)研究分子間相互作用，能夠直接、近乎瞬時(shí)地檢測(cè)結(jié)合于自由示蹤劑分子的比值。當(dāng)小的熒光分子在平面極化光的激發(fā)下，熒光壽命內(nèi)（激發(fā)與發(fā)射之間的時(shí)差）小分子在溶液中的旋轉(zhuǎn)速度快，所形成的發(fā)射光大部分是去極化的；但是，當(dāng)熒光分子結(jié)合到大分子后，它的有效體積增大，旋轉(zhuǎn)減慢，在與激發(fā)光相同平面上的發(fā)射光增多，去極化減弱，偏振增強(qiáng)。因此，熒光分子在自由狀態(tài)下偏振值較低，而在結(jié)合狀態(tài)偏振值較高，檢測(cè)到的偏振值是這兩個(gè)值的加權(quán)平均值，從而提供了直接檢測(cè)熒光分子結(jié)合到受體比值的方法［21-24］。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括某些疾病的診斷和監(jiān)測(cè)治療藥物在體內(nèi)的水平，進(jìn)而用于高通量篩選，為藥物的篩選提供了更加靈敏、簡(jiǎn)易、快速的方法。本實(shí)驗(yàn)利用熒光偏振法對(duì) PBD1抑制劑進(jìn)行篩選，并進(jìn)行一系列的活性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 人肺腺癌細(xì)胞 A549、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞 H460、人腎臟細(xì)胞Herk-293、人巨噬細(xì)胞 Raw、人直腸癌細(xì)胞 HT29、人結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT116及人前列腺癌細(xì)胞 PC3均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自北京四正柏生物科技有限公司；10 000個(gè)待篩化合物購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；PBD1重組蛋白由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳云雨博士提供；DMEM高糖培養(yǎng)基（hyclone）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；30%丙烯酰胺、4×濃縮膠緩沖液、4×分離膠緩沖液、考馬斯亮藍(lán)染色、NaCl、Tris-HCl、EDTA、RNA酶A（RNaseA）、碘化丙啶（PI）、噻唑藍(lán)（MTT）、DMSO均購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 Envision 2014 Multilabel Reader酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) PerkinElmer公司；FACS Caliur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó) Beckman Coulter公司；PowerPacTMHC穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光偏振法初篩化合物 30 μl體外表達(dá)純化的 PBD1蛋白（400 nmol/L）中加入受試化合物 0.3 μl（1 mg/ml），于 25℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 45 min，再加入 FITC標(biāo)記的多肽 30 μl （60 nmol/L），于 25℃、140 r/min下避光振蕩培養(yǎng) 15 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)。其中只加 PBD1和 FITC標(biāo)記多肽的作為陽(yáng)性對(duì)照，只加緩沖液和多肽的作為陰性對(duì)照。抑制率計(jì)算公式如下：

1.2.2 初篩陽(yáng)性化合物 IC50值的確定 分別將化合物稀釋為 10、5、2、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.02、0.01 μg/ml。按初篩的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用GraphPad Prism 5計(jì)算化合物在此熒光偏振模型上的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 MTT法檢測(cè)化合物細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為 2×104～5× 104/ml，接種于 96孔培養(yǎng)板中。細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度稀釋的化合物，化合物濃度分別為 200、100、75、25、10、5、1、0.5、0.1 μmol/L，同一濃度設(shè) 3個(gè)復(fù)孔。于 37℃ 含 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h，然后每孔加入 20 μl MTT（5 mg/ml）繼續(xù)孵育 4 h，再加入 150 μl DMSO振蕩 15 min。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定 570 nm波長(zhǎng)處 OD值。

應(yīng)用 GraphPad Prism 5計(jì)算化合物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè) 將 HeLa細(xì)胞鋪于 6孔板中，待細(xì)胞貼壁后加入 40 μl胸腺嘧啶（0.1 mol/L），使其終濃度為 2 mmol/L，此過(guò)程為第一次阻斷，孵箱培養(yǎng) 8～12 h后，PBS洗 3次，加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng) 12 h后進(jìn)行第二次阻斷，條件同第一次，經(jīng)兩次阻斷后加入濃度分別為 5、10、15、20、25 μmol/L的化合物 6143D7。收集作用 16 h后的樣品，PBS洗滌，以預(yù)冷的 70%乙醇固定至少1h。PBS洗滌、重懸細(xì)胞，加入 RNaseA，37℃ 恒溫孵育 30 min，加 PI室溫避光孵育 30 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以 ModFitLT軟件分析結(jié)果。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集 6143D7（0、15、25 μmol/L）作用 24 h后的 HeLa細(xì)胞，以 4℃ 預(yù)冷的 PBS洗滌，結(jié)合緩沖液重懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為 1×106個(gè)/ml，加入 Annexin V-FITC后室溫避光孵育 30 min，上機(jī)前 5 min加入 PI，F(xiàn)ACS分析。

1.2.6 化合物 6143D7與 PLK1激酶 PBD結(jié)構(gòu)域分子對(duì)接 利用 SYBYL7.3軟件首先將蛋白調(diào)出并對(duì)其進(jìn)行 3D模型的優(yōu)化，確定活性位點(diǎn)，再將化合物與活性位點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 熒光偏振模型初篩結(jié)果

利用熒光偏振模型對(duì) 10 000個(gè)化合物進(jìn)行PBD1抑制劑初篩，得到 1個(gè)陽(yáng)性化合物6143D7，在濃度為 1 mg/ml時(shí)能抑制 PBD1的活性，化合物結(jié)構(gòu)如圖 1所示。

圖1 化合物 6143D7的結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structure of compound 6143D7

2.2 初篩陽(yáng)性化合物對(duì) PBD1的抑制活性

對(duì)初篩陽(yáng)性化合物采用濃度梯度稀釋進(jìn)行 IC50的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)化合物 6143D7表現(xiàn)出較好的抑制作用，IC50值為（0.143±0.022）μmol/L（圖 2）。

圖2 6143D7對(duì)體外純化 PBD1的 IC50值Figure 2 The IC50of 6143D7 against purified PBD1 in vitro

2.3 MTT法檢測(cè)化合物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制

分別以不同細(xì)胞系進(jìn)行 MTT實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在A549、H460、HCT116、HT29上化合物 6143D7的作用并不敏感，對(duì) HeLa細(xì)胞作用敏感，IC50= 5.78 μmol/L，Raw細(xì)胞中 IC50值為 50.76 μmol/L，如表 1和圖 3所示。6143D7對(duì) HeLa細(xì)胞敏感，且 HeLa細(xì)胞比較常用，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用HeLa細(xì)胞進(jìn)行。

表1 6143D7對(duì)不同細(xì)胞株的毒性Table 1 Cytotoxicity of 6143D7 to different cells

2.4 化合物對(duì)細(xì)胞周期的影響

由于在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，不同時(shí)相的細(xì)胞對(duì)藥物干預(yù)存在不同反應(yīng)，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，因此，需要獲得周期一致性的細(xì)胞，利用細(xì)胞同步化技術(shù)可以達(dá)到此效果。將 HeLa細(xì)胞進(jìn)行胸腺嘧啶核酸雙阻斷，以 6143D7作用 16 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn) G2/M 期隨著化合物濃度的增加在整個(gè)細(xì)胞周期所占比例也有所增加。尤其是在 25 μmol/L時(shí)，由對(duì)照組的 0%增加到 22.33%（表 2）。這表明 6143D7有 G2/M 期阻滯作用，并且這種作用有明顯的劑量依賴關(guān)系。

圖3 6143D7在 HeLa細(xì)胞中的半數(shù)抑制率Figure 3 The IC50of 6143D7 for HeLa cells

表2 不同濃度的 6143D7作用下HeLa細(xì)胞周期分布（%）Table 2 Effect of 6143D7 on cell cycle progression of HeLa cells at different concentrations（%）

2.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，6143D7能夠促進(jìn) HeLa細(xì)胞的凋亡，尤其是晚期凋亡。如圖 4及表 3所示，6143D7作用 24 h后，15 μmol/L的化合物能誘導(dǎo) 22.69%的細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，25 μmol/L的化合物能誘導(dǎo) 79.15% 的細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡。

2.6 化合物與 PLK1 PBD分子對(duì)接

PLK1 PBD結(jié)構(gòu)域由 Lys540、His538、Lys540、Tyr485、Arg516、Asp416等氨基酸組成［25-30］。對(duì)接結(jié)果顯示，化合物 6143D7與 PLK1的 PBD結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出了較高的親和性，如圖 5的球棒模型圖所示，化合物 6143D7可以進(jìn)入 PBD1的活性口袋中，且對(duì)接方式主要是以 Lys540與苯環(huán)上羰基形成的氫鍵為主。

3 討論

近年來(lái)，癌癥的發(fā)生一直是危害人類健康的重要因素，各國(guó)科研人員也不斷地致力于抗癌藥物的研究。PLK1作為抗癌藥物的研究靶點(diǎn)，由于PLKs之間具有相似的激酶區(qū)結(jié)構(gòu)，使得這些抑制劑或多或少地對(duì) PLK2及 PLK3也有抑制作用，因此，其特異性就受到了限制。然而，PBD的特殊結(jié)構(gòu)成為尋找特異性 PLK1小分子抑制劑的一個(gè)新領(lǐng)域。

圖4 6143D7對(duì) HeLa細(xì)胞的促凋亡作用Figure 4 Treatment of HeLa cells with compound 6143D7 induced apoptosis

表3 不同濃度的 6143D7作用下 HeLa細(xì)胞凋亡分布（%）Table 3 Effect of 6143D7 on cell apoptosis of HeLa cells at different concentration（%）

圖5 6143D7與 PBD1活性區(qū)域的虛擬對(duì)接Figure 5 Virtual docking of 6143D7 with PBD1 domain

目前，已經(jīng)報(bào)道的 PLK1 PBD抑制劑主要包括小分子抑制劑和多肽類抑制劑。小分子抑制劑主要包括 poloxin［30］及其結(jié)構(gòu)類似物百里醌（thymoquinone，TQ）［31］、poloxipan、紅倍酚（purpurogallin，PPG）和綠茶兒茶素類等。但是，這些數(shù)量及結(jié)構(gòu)有限的小分子抑制劑多屬天然產(chǎn)物，極大地限制了靶向 PLK1 PBD小分子抑制劑基于結(jié)構(gòu)的定向設(shè)計(jì)。鑒于此，本研究采用熒光偏振高通量篩選模型對(duì)本室化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，以期定向獲得靶向 PLK1 PBD的新型抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物，初篩得到的化合物 6143D7是一類結(jié)構(gòu)新型的抗腫瘤化合物，MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6143D7在 HeLa細(xì)胞中抑制作用最為明顯，可能和此化合物作用的靶點(diǎn)蛋白在這幾種細(xì)胞系中的表達(dá)量不同有關(guān)，這也就決定了其對(duì)細(xì)胞系的不同敏感性。流式結(jié)果還表明，6143D7對(duì)癌細(xì)胞系的增殖抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。6143D7導(dǎo)致 HeLa細(xì)胞G2/M 期阻滯呈一定的量效關(guān)系，在 25 μmol/L 6143D7作用下，細(xì)胞 G2/M 期的比例明顯高于對(duì)照組。6143D7促進(jìn) HeLa細(xì)胞的凋亡則更為明顯，量效關(guān)系也更突出，這也與已發(fā)現(xiàn)的 PBD1抑制劑作用效果類似，經(jīng)過(guò)分子對(duì)接也進(jìn)一步證實(shí)了PBD1為化合物的作用靶點(diǎn)。

總之，本研究驗(yàn)證了 6143D7的體外抗癌活性，提示其具有較好的抗癌研究和開(kāi)發(fā)前景，表明該化合物具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。接下來(lái)將對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造以進(jìn)一步提高其抗腫瘤活性。

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Methods The influence of the positive compound on cells'proliferation was measured by MTT assay.The compound's effects oncell cycle and apoptosis in HeLa cells was decided by flow cytometry（FCM）.The compound’s affinity with PBD1 domain was determined by molecular docking.

Results The positive compound 6143D7 was found from high-throughput screening by fluorescence polarization assay.In vitro antitumor results revealed that the compound inhibited the proliferation of human cancer cell lines.6143D7 induced cell cycle arrest and promoted apoptosis of the cancer cells by FCM assess.Molecular docking showed that 6143D7 had good affinity with the PBD1 domain.

Conclusion The compound 6143D7 is expected to become one of the anti-cancer drug candidates against PLK1 PBD.

Screening and anti-tumor activity of small molecular inhibitors targeting PLK1 PBD

ZHANG Zhi-hui，ZHANG Jing，LIU Wei，CHEN Yun-yu，SI Shu-yi，WANG Yan-hong

Objective Fluorescence polarization assay will be used to find potential small-molecular inhibitors targeting PLK1 PBD through high-throughput screening，and then the anti-tumor effects of positive compound 6143D7 will be evaluated in vitro.

Protein-serine-threonine kinases；Drug screening assays，antitumor；Fluorescence polarization；Polo-like kinase 1 inhibitor

s:SI Shu-yi，Email:sisyimb@hotmail.com；WANG Yan-hong，Email:wang.yanhong@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.006

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81370087）

150040哈爾濱，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（張智慧、王艷宏）；100050北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國(guó)家新藥（微生物）篩選實(shí)驗(yàn)室（張晶、劉偉、陳云雨、司書(shū)毅）

司書(shū)毅，Email：sisyimb@hotmail.com；王艷宏，Email：wang.yanhong@163.com

2015-01-07

*同為第一作者

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（2）:125-130

Author Affiliations:College of Pharmacy，Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China（ZHANG Zhi-hui，WANG Yan-hong）；National Laboratory for Screening New（Microbial）Drugs，Institute of Medicinal Biotechnology，Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China（ZHANG Jing，LIU Wei，CHEN Yun-yu，SI Shu-yi）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:125-130