張娜，劉璐，竇玥瑩，王真，宋丹青，李電東，鄧洪斌

載體介導的RNA干擾技術抑制肝癌細胞中糖原合成酶激酶3β表達的研究

張娜，劉璐，竇玥瑩，王真，宋丹青，李電東，鄧洪斌

目的 構建和篩選能高效、特異性抑制人 GSK-3β基因表達的 siRNA表達載體，探討其對肝癌細胞增殖和凋亡的影響。

方法 提取人 L02細胞總 RNA，RT-PCR擴增 GSK-3β基因序列，克隆至 pSEB-HUS真核表達載體，構建 pSEB-G重組質粒。將設計、合成的 3條靶向 GSK-3β基因編碼區(qū)的siRNA及陰性對照分別克隆至pSEB-G，構建siRNA表達載體 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及 pSEB-siN-G。將 siRNA表達載體瞬時轉染 HepG2細胞，通過綠色熒光信號、RT-PCR和 Western blot觀察和檢測其對 GSK-3β基因的抑制效果，MTT實驗和 caspase-3活性分析檢測其對 HepG2細胞增殖和凋亡的影響。

結果 經雙酶切及測序證實，所構建 siRNA表達載體目的基因大小、序列與預期相符。瞬時轉染 HepG2細胞后，其中的 pSEB-si1-G能使細胞中綠色熒光信號明顯減少，可顯著抑制 GSK-3β mRNA的表達及蛋白的合成，并使 HepG2細胞增殖明顯降低，caspase-3活性顯著升高。

結論 成功構建了靶向 GSK-3β基因的 siRNA表達載體，沉默 GSK-3β能顯著抑制 HepG2細胞的生長并誘導其發(fā)生凋亡。

糖原合成酶激酶 3β； RNA干擾； 癌，肝細胞； siRNA表達載體

糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在肝細胞等真核細胞中廣泛存在，于 20世紀 70年代末被發(fā)現(xiàn)和鑒定［1-2］。GSK-3β定位于染色體 3q13.3，主要由氨基端、激酶區(qū)和羧基端 3個結構域組成，其參與胰島素、Wnt、Hedgehog以及Notch等多種信號傳導通路，在調控細胞的增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生等方面都發(fā)揮重要作用［3］。GSK-3β活性的紊亂促進包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)生和發(fā)展［4-5］。

研究發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在多種腫瘤中具有促進腫瘤生長的作用。如在 90%腎癌細胞核中發(fā)現(xiàn)存在GSK-3β的異常聚集，抑制 GSK-3β活性后可顯著降低腎癌細胞的增殖與存活［6］。GSK-3β還可促進急性骨髓性白血病（AML）的發(fā)生［7］。在胰腺癌中也存在 GSK-3β的高表達，其通過激活 IKK-NF-κB通路促進胰腺癌細胞的存活［8］。因此，GSK-3β已成為眾多腫瘤防治的一個新靶標［9］。

目前有關 GSK-3β在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確。本實驗擬通過構建、設計抑制 GSK-3β基因表達的 siRNA載體，在肝癌細胞 HepG2中表達靶向 GSK-3β的 siRNA分子，觀察不同siRNA分子對 GSK-3β的抑制效果及其對肝癌細胞增殖能力和凋亡的影響，初步探討 GSK-3β在肝癌形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和細胞 pSEB-HUS siRNA表達載體（圖 1）［10］由美國芝加哥大學 Tong-chuan He教授惠贈。大腸桿菌 DH5α、人正常肝細胞 L02、肝癌細胞株 HepG2由本實驗室保存。

圖1 siRNA表達載體構建示意圖Figure 1 Schematic diagram of siRNA expression vector construction

1.1.2 主要試劑 細胞總 RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性內切酶、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購自大連寶生物公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國 Hyclone公司；caspase-3底物 DEVD-AFC、GSK-3β抗體、β-actin抗體和羊抗兔或小鼠二抗購自美國 Santa Cruz公司；GenEscort II轉染試劑購自南京慧基生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；ECL Plus超敏免疫印跡檢測試劑盒購自美國 Bio-Rad公司；MTT購自美國 Sigma公司；β-半乳糖苷酶檢測試劑盒購自美國 Promega公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 儀器 Berthold LB942熒光檢測儀為德國伯托公司產品；ChemiImager 5500凝膠成像系統(tǒng)為美國 Alpha公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人 GSK-3β基因的擴增

1.2.1.1 細胞總 RNA的提取 收集人正常肝細胞 L02，裂解后用細胞總 RNA抽提試劑盒提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，–80℃ 保存。

1.2.1.2 RT-PCR 根據 GenBank中人 GSK-3β基因序列（NM_001146156），設計正向和反向引物，其中正向引物含 Bgl II酶切位點（5'GAAGATCTA TGTCAGGGCGG CCCAGAACCA 3'）、反向引物含Xho I酶切位點（5'CCGCTCGAGTCAAGTGGAG TTGGAAGCTGATGC 3'）。按照 Takara RNA PCR試劑盒說明進行 RT-PCR，逆轉錄條件為：37℃15 min，85℃5 s；PCR條件為：94℃ 變性 45 s，58℃ 退火 45 s，72℃ 延伸 2 min，共 30個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察后膠回收 1263 bp基因片段。

1.2.2 真核表達載體 pSEB-G的構建 用 Bgl II、 Xho I雙酶切 PCR膠回收產物和真核表達載體pSEB-HUS，酶切產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收，T4 DNA連接酶 18℃ 連接 3 h，轉化感受態(tài) DH5α大腸桿菌，氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，雙酶切鑒定正確后送上海生物工程公司測序。陽性克隆載體命名為 pSEB-G。

1.2.3 siRNA真核表達質粒載體的構建

1.2.3.1 siRNA序列設計 利用 Ambion siRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，分析人 GSK-3β基因的編碼區(qū)（NM_001146156）序列，依據 siRNA靶序列設計原則，經 BLAST同源性分析，選擇確定 3對靶序列，同時設計 1對陰性對照序列，由上海生物工程公司合成。設計的 siRNA及陰性對照序列見表1。

1.2.3.2 siRNA表達載體構建 將合成的 siRNA片段用 ddH2O配成終濃度為 1 μg/μl，100℃ 煮沸5 min后室溫下慢慢冷卻使之退火，再與經 Sfi I酶切的 pSEB-G質粒進行連接，進而分別將siRNA片段克隆進 pSEB-G載體中，經轉化和氨芐青霉素抗性篩選后，用菌落 PCR的方法挑取陽性克?。?'端使用H1（CCAGCTTAATTCGAACGC TGACGT）引物，3'端使用 sense siRNA引物，PCR條件為：94℃ 變性 30 s，50℃ 退火 30 s，72℃延伸 30 s，共 30個循環(huán)。菌落 PCR鑒定的陽性克隆質粒送上海生物工程公司測序，分別命名為pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G、pSEB-siN-G（陰性對照質粒）。

表1 3對 GSK-3β siRNA和陰性對照 siRNA序列Table 1 Sequences of three GSK-3β siRNAand one negative control

1.2.4 siRNA表達載體轉染細胞 將 HepG2細胞接種于 6孔板，當細胞密度達 70%～80%時進行轉染。將 6 μl GenEscort II轉染試劑與 100 μl PBS混合，再將 1 μg siRNA表達載體與 100 μl PBS混合，然后將上述兩種溶液輕輕混勻，室溫放置 15 min后，加入到每孔含 400 μl DMEM 培養(yǎng)基的 6孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng) 6 h后，改用含10%FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基，連續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

1.2.5 最佳 siRNA表達載體的篩選 分別將pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G及pSEB-siN-G質粒與 pCMV-β-galactosidase質粒用 GenEscort II共轉染至對數生長期的 HepG2細胞，72 h后置熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。為定量檢測 GFP蛋白的熒光變化，將轉染后的細胞裂解后用熒光檢測儀進行測定，同時測定其 β-半乳糖苷酶活性，各孔的熒光數值與 β-半乳糖苷酶活性的比值即為GFP的熒光強度。

1.2.6 RT-PCR檢測 GSK-3β mRNA水平變化 收集轉染 72 h的細胞，用 Trizol試劑提取總 RNA。逆轉錄：取 HepG2細胞總 RNA 2 μg，oligo（dT）18引物 2 μl，DEPC水補足至 12.5 μl，70℃ 溫育5 min，冰上冷卻后依次加入 5×緩沖液 5 μl、2.5 μl 10 mmol/L dNTP、M-MLV逆轉錄酶 1 μl，42℃ 溫育 60 min，進行 cDNA第一鏈的合成，95℃5 min終止反應。PCR：以 β-actin作為內參對照，檢測GSK-3β基因表達水平變化。GSK-3β上游引物：5'ATTTCCAGGGGATAGTGGTGT 3'，下游引物：5'GGTCGGAAGACCTTAGTCCAAG 3'；β-actin上游引物：5'GGCTGTATTCCCCTCCATCG 3'，下游引物：5'CCAGTTGGTAACAATGCCATGT 3'。

1.2.7 Western blot 將細胞用細胞刮刀刮下，1200×g離心收集細胞。加入適量裂解液（50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5、1%Triton-100、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA、1 mmol/L NaVO3、50 mmol/L NaF、1 mmol/L PMSF、1 mg/ml抑肽酶、1 mmol/L亮抑酶肽），冰浴 30 min后，14 000×g離心 15 min，收集上清即為蛋白提取液。用標準 Bradford方法測定樣品的蛋白濃度。于 12%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干法將蛋白轉至 PVDF膜。轉膜結束后，將其放入含 5%脫脂奶粉的 TBST （20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl、0.1%吐溫-20，pH 7.6）中振蕩封閉 1 h，再與 GSK-3β或β-actin一抗溶液（1∶1000稀釋）4℃ 孵育過夜，之后用 TBST洗膜 3次，與辣根過氧化物酶標記的二抗溶液（抗兔二抗 1∶2000稀釋、抗鼠二抗1∶5000稀釋）在室溫孵育 1～2 h后，TBST洗膜3次，按照 ECL Plus免疫試劑盒說明書進行顯色，通過 ChemiImager 5500凝膠成像系統(tǒng)捕獲并分析圖像。

1.2.8 MTT法檢測 HepG2細胞增殖的變化 取對數生長期 HepG2細胞制備單細胞懸液，以 6× 103個/孔細胞密度接種于 96孔板，每組設置 6個復孔，同時設空白對照（僅加培養(yǎng)液）。待細胞密度達到 50%左右，轉染相應的 siRNA表達質粒，分別于轉染 1～5 d后，每孔加入 20 μl（5 mg/ml）MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加入 150 μl DMSO，振蕩 10 min，使紫色結晶充分溶解，酶標儀檢測各孔吸光度（A570）值。

1.2.9 caspase-3活性分析檢測 HepG2細胞凋亡的變化 按照本實驗室發(fā)表的方法［11］檢測細胞中caspase-3的活性。HepG2細胞轉染相應的 siRNA表達質粒 72 h后，收集細胞。加入細胞裂解液冰浴 30 min后，14 000×g離心 15 min收集上清。分別將 50 μg上清與 10 μg DEVD-AFC底物加到 1 ml反應液（12 mmol/L HEPES、2.5 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT和 0.1%CHAPS）中，37℃溫育 2 h后，熒光光度計讀取相應數值，激發(fā)波長400 nm 和發(fā)射波長 505 nm 讀數的比值代表caspase-3活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

每次試驗至少重復 3次，實驗結果采用 t檢驗進行統(tǒng)計分析，各組數據采用± s 表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GSK-3β RT-PCR擴增結果

提取 L02細胞總 RNA，進行 RT-PCR，擴增產物經 1%瓊脂糖凝膠電泳后，在約 1263 bp處呈現(xiàn)特異性目的條帶，與人 GSK-3β基因的編碼區(qū)大小相符（圖 2）。

圖2 人 GSK-3β基因的 RT-PCR結果Figure 2 RT-PCR result of human GSK-3β

2.2 pSEB-G重組質粒的構建及鑒定

重組 pSEB-G質粒經 Bgl II、Xho I雙酶切后，得到 1條約 1263 bp的目的條帶及線性空載體條帶，而空載體 pSEB-HUS經雙酶切后僅有一條線性條帶（圖 3）。此外，重組 pSEB-G質粒靶基因的測序結果與 GenBank中人 GSK-3β基因序列（NM_001146156）完全一致。以上結果表明，含人 GSK-3β基因的重組質粒 pSEB-G構建成功。

圖3 pSEB-G重組質粒的 Bgl II、Xho I雙酶切鑒定結果Figure 3 Bgl II and Xho I double digestion result of recombinant plasmid pSEB-G

A：pSEB-si1-G；B：pSEB-si2-G；C：pSEB-si3-G；D：pSEB-siN-G

2.3 siRNA表達載體的構建

將合成好的 siRNA退火后，與 Sfi I酶切后的pSEB-G質粒進行連接，轉化 DH5α，挑取克隆進行菌落 PCR，對菌落 PCR出現(xiàn)目的條帶的克隆進行 DNA序列測定，均得到與設計一致的陽性克?。▓D 4）。表明靶向 GSK-3β的 siRNA表達載體pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G以及陰性對照載體 pSEB-siN-G構建成功。

2.4 siRNA表達載體轉染 HepG2細胞后 GFP綠色熒光蛋白的表達差異

分別將 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G、pSEB-si3-G、pSEB-siN-G和 pSEB-G質粒用 GenEscort II瞬時轉染 HepG2細胞，72 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，并定量檢測 GFP熒光強度的變化（圖 5）。結果表明，與對照組相比，pSEB-si1-G轉染組的綠色熒光信號（31.6%）明顯弱于其他組，pSEB-si3-G轉染組的綠色熒光信號（62.7%）也有所減弱，而 pSEB-si2-G轉染組的綠色熒光信號（84.2%）則變化不大，說明 pSEB-si1-G 對 GSK-3β的干擾效果最好。

A：分別將等量的 pSEB-G、pSEB-siN-G、pSEB-si1-G、pSEB-si2-G或 pSEB-si3-G質粒轉染 HepG2細胞，72 h后熒光顯微鏡觀察 siRNA對 GFP蛋白表達的抑制情況；B：將等量的 pSEB-G、pSEB-siN-G、pSEB-si1-G、pSEB-si2-G或 pSEB-si3-G質粒與 pCMV-β-galactosidase質粒共轉染HepG2細胞，72 h后裂解并收集細胞，定量測定熒光強度，各孔的轉染效率用 β-半乳糖苷酶活性進行檢測（*P＜0.05）A:HepG2 cells were transfected with an equal amount of pSEB-G，pSEB-siN-G，pSEB-si1-G，pSEB-si2-G or pSEB-si3-G plasmids，the inhibition of GFP expression by siRNAs was recorded at 72 h under a fluorescence microscope；B:HepG2 cells were transfected with an equal amount of pSEB-G，pSEB-siN-G，pSEB-si1-G，pSEB-si2-G or pSEB-si3-G plasmids，along with pCMV-β-galactosidase.At 72 h，the transfected cells were lyzed and subjected to fluorescence measurement.Transfection efficiency was normalized with β-galactosidase activity（*P＜0.05）

2.5 siRNA對 GSK-3β mRNA和蛋白的影響

RT-PCR結果表明，轉染 siRNA表達載體的HepG2細胞中 GSK-3β mRNA的表達均受到不同程度抑制（圖 6A）。其中 pSEB-si1-G轉染組的抑制效果最強，達到幾乎完全抑制的效果；pSEB-si3-G轉染組也有抑制作用；pSEB-si2-G轉染組的抑制效果最差。而陰性對照組和轉染空載體的 HepG2細胞中都存在較高水平的 GSK-3β mRNA表達。

Western blot結果表明，轉染空載體和陰性對照組的 HepG2細胞中 GSK-3β蛋白呈現(xiàn)高表達，GSK-3β蛋白印跡出現(xiàn)在 47 kD處，與人 GSK-3β相對分子質量一致；而轉染 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G 和 pSEB-si3-G的實驗組細胞中，GSK-3β蛋白的表達均受到抑制（圖 6B）。其中 pSEB-si1-G的抑制作用要優(yōu)于其他兩個，GSK-3β蛋白的表達下降90% 以上。以上結果說明 pSEB-si1-G為可高效抑制 GSK-3β mRNA和蛋白表達的 siRNA表達載體。

圖6 不同 siRNA對 GSK-3β的干擾效果Figure 6 Knockdown efficiency of siRNAs on GSK-3β

2.6 干擾GSK-3β的表達能有效抑制 HepG2細胞的增殖

將靶向 GSK-3β的 siRNA表達質粒轉染細胞后，用 MTT法檢測細胞增殖情況，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔的吸光度，以時間作為橫坐標，吸光度值作為縱坐標繪制生長曲線。結果顯示：與對照組細胞相比，轉染 pSEB-si1-G和 pSEB-si3-G的實驗組細胞的增殖均受到抑制，其中 pSEB-si1-G組的抑制作用要優(yōu)于 pSEB-si3-G組（圖 7）。

圖7 GSK-3β siRNA對 HepG2細胞增殖的影響（*P＜0.05）Figure 7 Effect of GSK-3β siRNAs on HepG2 cell proliferation（*P＜0.05）

2.7 干擾 GSK-3β的表達可誘導 HepG2細胞凋亡的發(fā)生

caspase家族在介導細胞凋亡的過程中發(fā)揮非常重要的作用，其中 caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子。caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活并最終導致細胞凋亡，但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞中，caspase-3的活性明顯下降。將表達 pSEB-si1-G、pSEB-si3-G和 pSEB-siN-G的 siRNA表達質粒轉染 HepG2細胞后，收集細胞檢測 caspase-3活性的變化。結果顯示，與對照組相比，轉染 pSEB-si1-G、pSEB-si3-G 組 HepG2細胞中 caspase-3活性均上升，其中pSEB-si1-G組上升更為明顯，說明 pSEB-si1-G可顯著誘導 HepG2細胞發(fā)生凋亡（圖 8）。

圖8 GSK-3β siRNA對 HepG2細胞 caspase-3活性的影響（*P＜0.05）Figure 8 Effect of GSK-3β siRNAs on the caspase-3 activity of HepG2 cell（*P＜0.05）

3 討論

RNA干擾（RNAi）是指內源性或外源性雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）導致細胞內同源mRNA發(fā)生特異性降解的過程［12］。RNAi作為一種新型的基因沉默工具，因其具有高效性、高特異性和低毒性等優(yōu)點，已成為從基因到功能的反向遺傳學研究的熱門首選。小分子干擾 RNA （siRNA）的制備方法包括化學合成、體外合成、RNase III酶切 dsRNA、siRNA表達載體以及siRNA表達框架，不同方法適合不同的研究方法和目的。其中 siRNA表達載體法可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達［13］，已逐漸成為進行 RNAi研究的首選。本實驗中，我們選用的是芝加哥大學醫(yī)學中心 Tong-chuan He教授構建的高效篩選 siRNA的質粒表達載體 pSEB-HUS。其含有 GFP與目的基因的嵌合轉錄子，使 siRNA對目的基因的沉默效率直接影響 GFP蛋白的表達，siRNA對目的基因的沉默效果越明顯，則 GFP蛋白的表達越弱［10］，實現(xiàn)了對 siRNA靶序列的高效篩選。

一系列的研究表明，GSK-3β在許多腫瘤細胞和人類腫瘤組織中高表達［14］。隨著與GSK-3β相互作用分子的不斷發(fā)現(xiàn)，GSK-3β在腫瘤形成中的重要作用受到越來越多的關注。目前有關 GSK-3β在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用還不明確。本研究利用Ambion公司的 siRNA靶序列分析設計系統(tǒng)，設計了 3對以人 GSK-3β為目標基因的 RNAi新序列（均未見文獻報道），成功構建了 siRNA表達載體 pSEB-si1-G、pSEB-si2-G和 pSEB-si3-G和1個陰性對照表達載體 pSEB-siN-G。將質粒轉染入 HepG2細胞中，通過觀察綠色熒光，pSEB-si1-G轉染組綠色熒光信號明顯弱于其他組，表明其對GSK-3β基因的抑制率最高，并可在 mRNA水平和蛋白水平抑制 GSK-3β的表達。siRNA與靶序列的結合與 mRNA的二級結構密切相關，靶向折疊程度較高區(qū)段設計的 siRNA序列可能很難與mRNA結合，其對目的基因的抑制效果就較差。本研究中 pSEB-si1-G對 GSK-3β的抑制效果要優(yōu)于其他兩個，很可能是因為它的靶序列所在區(qū)域的折疊程度不高，利于其與 GSK-3β mRNA的結合。

為了研究 GSK-3β是否對肝癌細胞的生長和生存發(fā)揮重要作用，我們利用構建好的 siRNA表達載體下調了肝癌細胞 HepG2中 GSK-3β的表達，并分別檢測了細胞的增殖和凋亡情況。由于我們構建的 siRNA表達載體中含有 GFP表達元件，對Annexin V和 PI的熒光信號會造成一定的干擾，因此不適合用 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡。鑒于 caspase-3在早期凋亡中的重要作用，我們通過分析細胞中 caspase-3活性的變化來反映細胞凋亡的改變。結果表明，pSEB-si1-G抑制GSK-3β的表達后，可明顯抑制 HepG2細胞的增殖，并促進細胞凋亡的發(fā)生。因此我們認為，GSK-3β的表達與肝癌細胞 HepG2的生長和生存密切相關，提示 GSK-3β可以作為肝癌基因治療的有效靶點，有關 GSK-3β調控肝癌細胞生長和生存的具體機制還有待進一步的研究。

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Methods The cDNA of GSK-3β was amplified by RT-PCR from the total RNA of L02 cells，and then inserted into pSEB-HUS vector to generate pSEB-G plasmid.The synthesized siRNAs targeting the coding region of human GSK-3β were cloned into pSEB-G respectively，resulting in the pSEB-si1-G，pSEB-si2-G，pSEB-si3-G and pSEB-siN-G plasmids.These plasmids were transiently transfected into HepG2 cells，and the expression levels of GSK-3β were detected by green fluorescent signal，RT-PCR，and Western blot.The effects of siRNAs on proliferation and apoptosis of HepG2 cells were determined by MTT assay and caspase-3 activity assay.

Results All plasmids were successfully constructed as confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing.The pSEB-si1-G vector had the most significant knockdown effect on GSK-3β among the constructed plasmids.GSK-3β silencing resulted in marked decrease of proliferation and increase of caspase-3 activity in HepG2 cells.

Conclusion A siRNA expression vector targeting GSK-3β is successfully constructed and validated for its knockdown effect，and silencing of GSK-3β can significantly inhibit HepG2 cell proliferation and induce its apoptosis.

Vector-mediated RNAinterference of GSK-3β expression in hepatoma cell

ZHANG Na，LIU Lu，DOU Yue-ying，WANG Zhen，SONG Dan-qing，LI Dian-dong，DENG Hong-bin

Objective To construct a vector expressing siRNA targeting human GSK-3β gene and to investigate its effects on proliferation and apoptosis of HepG2 cells.

Glycogen synthase kinase 3β；RNAinterference；Carcinoma，hepatocellular；siRNAvector

DENG Hong-bin，Email:hdeng@imb.pumc.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.007

北京協(xié)和醫(yī)學院“協(xié)和青年基金”（3332013144）；國家自然科學基金面上項目（81473248、81170326）

100050北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所生化室

鄧洪斌，Email：hdeng@imb.pumc.edu.cn

2014-09-02

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術，2015，10（2）:131-138

Author Affiliation:Department of Biochemistry，Institute of Medicinal Biotechnology，Chinese Academy of Medical Sciences& Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:131-138