林媛，朱寧嶼，蔣建東，司書毅

結(jié)核分枝桿菌FtsZ抑制劑的篩選和活性研究

林媛，朱寧嶼，蔣建東，司書毅

目的 篩選結(jié)核分枝桿菌 FtsZ的特異性抑制劑，為抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供先導化合物。

方法 應(yīng)用本實驗室已經(jīng)建立的結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑篩選模型對化合物庫進行篩選，獲得能夠抑制 FtsZ的化合物 202E，對其進行 IC50以及分子水平活性測定，并利用 DS 4.0軟件將化合物 202E與 FtsZ的活性位點進行對接。

結(jié)果 化合物 202E能夠抑制結(jié)核分枝桿菌 FtsZ的 GTP酶活性，其 IC50為15.46 μmol/L。202E還能夠抑制 FtsZ蛋白的聚合。通過分子對接，發(fā)現(xiàn) 202E能夠與 FtsZ的GTP結(jié)合位點結(jié)合，抑制 FtsZ的 GTP酶活性。

結(jié)論 化合物 202E是活性較好的結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑。

結(jié)核分枝桿菌； 酶抑制劑； FtsZ

結(jié)核病近年來在全球范圍有卷土重來的趨勢，主要原因是多重耐藥結(jié)核桿菌（MDR）的出現(xiàn)以及結(jié)核分枝桿菌與人類免疫缺陷病毒（HIV）的聯(lián)合感染。在過去的幾十年中，幾乎沒有新型高效的抗結(jié)核藥物被研發(fā)出來［1］。直到 2012年底，美國FDA批準二芳基喹啉上市，雖然其具有抗結(jié)核活性，但是體內(nèi)毒性較大［2］。因此，尋找新的有效的抗結(jié)核藥物成為我國乃至世界結(jié)核病防治的重要任務(wù)。

細菌結(jié)構(gòu)蛋白 FtsZ是真核細胞微管蛋白類似物。細胞分裂時，在 GTP存在下，F(xiàn)tsZ在細胞內(nèi)膜中心聚合成多聚體，形成高度螺旋結(jié)構(gòu) Z環(huán)［3-4］。之后，在其他分裂蛋白的參與下，使 Z環(huán)逐漸縮小導致隔膜形成，最終導致細胞分裂。FtsZ在包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的原核細胞分裂過程中都發(fā)揮著重要的作用，并且?guī)缀跛性思毎?FtsZ都是高度保守的，因此，以 FtsZ為靶點的藥物能夠抑制多種病原微生物。同時，原核細胞的 FtsZ與真核生物的同種功能蛋白之間有較大差異，因此，F(xiàn)tsZ被認為是一個很好的抗結(jié)核藥物研究靶點［5-6］。

本研究以 FtsZ為靶點，利用前期工作中建立的結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑篩選模型［7］，對國家新藥（微生物）篩選實驗室化合物庫進行篩選，尋找到結(jié)構(gòu)新穎的抗結(jié)核先導化合物，為抗結(jié)核藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 帶有 FtsZ基因的表達工程菌pET16b-FtsZ（BL21）由本室構(gòu)建；恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）mc2155購自美國標準生物品收藏中心（ATCC）。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 孔雀綠、GTP、DMSO購自美國 Sigma公司；30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液、4×分離膠緩沖液、4×濃縮膠緩沖液、R-250考馬斯亮藍染色液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；7H9培養(yǎng)基、ADC增菌液購自美國 BD公司；化合物 202E購自北京百靈威科技有限公司；篩選所用化合物庫來自國家新藥（微生物）篩選實驗室，純度 ＞95%。

1.1.3 儀器 EnVision2014型酶標儀為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品。

1.1.4 對接軟件 Discovery Studio（DS）4.0購自美國Accelrys公司。

1.2 方法

1.2.1 恥垢分枝桿菌對化合物庫進行初篩 由于結(jié)核分枝桿菌生長速度過慢，無法滿足大量的體外篩選要求，因此我們選擇與結(jié)核分枝桿菌高度同源的恥垢分枝桿菌 Mycobacterium smegmatis mc2155作為體外篩選的模式菌（結(jié)核分枝桿菌 H37Rv與恥垢分枝桿菌 Mycobacterium smegmatis mc2155 的 FtsZ蛋白相似性達 95%），對化合物庫 2萬個樣品進行初步篩選。篩選方法如下：恥垢分枝桿菌用 7H9培養(yǎng)基（含 10%ADC增菌液）培養(yǎng)，接種于 96微孔板中，接菌量為 5×105cfu/ml，每孔200 μl。化合物庫的篩選終濃度為 10 μg/ml。37℃培養(yǎng) 24 h觀察結(jié)果。將抑制恥垢分枝桿菌生長的化合物建立初篩陽性庫。

1.2.2 以結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑篩選模型篩選初篩陽性庫 利用之前構(gòu)建的結(jié)核分枝桿菌FtsZ抑制劑篩選模型對初篩陽性庫進行篩選，方法同文獻［7］：待測的化合物樣品終濃度為 10 μg/ml，與 FtsZ（12μmol/L）蛋白室溫孵育 30 min，之后加入 GTP（1 mmol/L），在 37℃ 孵育 15 min。緩沖液選用 50 mmol/L Tris，5 mmol/L MgCl2，pH 7.5。加入 200μl酸性溶液終止反應(yīng)，該酸性溶液的成分包括 0.045%（W/V）孔雀綠，4.2%鉬酸銨（溶于 4 mol/L HCl），5‰（V/V）濃 HCl。用酶標儀檢測 650 nm處的吸光值。同時設(shè)立空白對照：以不加 FtsZ為陽性對照（即酶活性完全被抑制），以等體積的DMSO為陰性對照（即未加抑制劑）。

其中，△FN是陰性對照孔吸光值；△FS是樣品實驗孔吸光值；△FP是陽性對照孔吸光值。以抑制率 ＞50%為陽性。

1.2.3 活性化合物 IC50測定 將篩選得到的活性化合物 202E溶于 DMSO中，配置成 10 mg/ml（22 mmol/L）的母液。之后將化合物倍比稀釋，按照文獻［7］分別獲得不同濃度條件下的抑制率，以抑制劑濃度的對數(shù)為橫坐標，抑制率為縱坐標，利用 graphpad prism5軟件計算 IC50。

1.2.4 蛋白水平檢測活性化合物對 FtsZ多聚體形成的影響 FtsZ蛋白用聚合緩沖液（50 mmol/LMES、5 mmol/L MgCl2、100 mmol/L KCl，pH 6.5）溶解至濃度為 5μmol/L，加入不同濃度（25、50、100μmol/L）活性化合物 202E，同時加入 1 mmol/L GTP，在 25℃ 孵育 10 min，287 000×g高速離心 30 min，取沉淀樣品，跑 SDS-PAGE電泳。比較加入陽性化合物前后 FtsZ多聚體形成的量。

1.2.5 活性化合物對恥垢分枝桿菌的 MIC測定 在 96微孔板中進行，恥垢分枝桿菌用 7H9培養(yǎng)基（含 10%ADC增菌液）培養(yǎng)，接菌量為5×105cfu/ml，每孔 200 μl?；衔锏慕K濃度為0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10 μg/ml（0.7、1.4、2.75、5.5、11、22 μmol/L）。37℃ 培養(yǎng) 24 h觀察結(jié)果。

1.2.6 活性化合物與 FtsZ蛋白活性位點的對接 采用 Discovery Studio4.0軟件進行分子對接。從 PDB數(shù)據(jù)庫中下載 FtsZ的 PDB（ID：2Q1Y）文件，進行預(yù)處理，去水，加氫，處理蛋白，以補充文件中氨基酸殘基。將 FtsZ定義為受體，定義GTP結(jié)合位點和找到結(jié)合空腔，然后定義結(jié)合球，確定結(jié)合區(qū)域坐標。對接時，采用 CDOOKER程序，將 FtsZ定義為受體，202E定義為配體，選擇結(jié)合區(qū)域坐標，運行程序。完成后，可在結(jié)果中獲得結(jié)合能、形成鍵等多項參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 恥垢分枝桿菌初篩陽性庫結(jié)果

用恥垢分枝桿菌對化合物庫 2萬個樣品進行篩選，共得到 65個初篩陽性化合物，建立初篩陽性庫。

2.2 結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑篩選模型篩選結(jié)果

用結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑篩選模型對初篩陽性庫進行篩選，抑制率 ＞50%則認為陽性。共得到 3個對結(jié)核分枝桿菌 FtsZ有抑制作用的化合物。其中抑制率較高的為 202E，結(jié)構(gòu)見圖 1。

圖1 化合物 202E的結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of compound 202E

2.3 陽性化合物 202E IC50的測定

化合物 202E對FtsZ的 GTP酶活性抑制作用如圖 2所示。隨著 202E濃度的增高，對 FtsZ 的 GTP酶活性抑制作用越來越強，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。通過用軟件 graphpad prism5擬合曲線得知，202E對 FtsZ的 GTP酶IC50約為15.46 μmol/L。

圖2 化合物 202E對 FtsZ IC50的測定Figure 2 IC50of GTPase activity of FtsZ by 202E

2.4 化合物 202E對 FtsZ多聚體形成的影響

FtsZ蛋白單體在 GTP存在的情況下可以聚合成 FtsZ多聚體，而 FtsZ多聚體再進一步聚合就可以形成細胞分裂過程中的隔板。經(jīng)過檢測，如圖 3所示，未加入化合物的 FtsZ在含有 GTP的聚合緩沖液中，發(fā)生了明顯的聚合。對照為未加入GTP的 FtsZ，沒有明顯的聚合現(xiàn)象。而隨著 202E濃度的增高，形成的 FtsZ聚合物逐漸減少。提示化合物 202E抑制了 FtsZ的聚合。

2.5 化合物 202E對恥垢分枝桿菌活性測定

經(jīng)測定，化合物 202E有抗恥垢分枝桿菌活性，其 MIC為 2.5 μg/ml（5.5 μmol/L）。

2.6 化合物 202E和結(jié)核分枝桿菌 FtsZ活性位點的對接

評價分子間相互作用通常以能值作為評判標準。能值的負絕對值越大，證明受體與底物的對接親和力越大，同時也預(yù)測了小分子與受體結(jié)合的活性也越高［8］。經(jīng)過軟件分析，化合物 202E與結(jié)核分枝桿菌 FtsZ蛋白間相互作用的能值為160.52 kJ/mol。對接分析結(jié)果表明，化合物 202E與FtsZ的 GTP結(jié)合位點的結(jié)合主要是靠氫鍵結(jié)合力，這也是小分子與蛋白間相互作用的主要結(jié)合鍵。圖 4A顯示的是 202E與 FtsZ蛋白 GTP結(jié)合區(qū)的結(jié)合位置。圖 4B給出參與 202E和 FtsZ相互作用的氨基酸和形成的氫鍵。

圖3 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示 202E抑制 FtsZ的聚合Figure 3 SDS-PAGE shows the inhibition of FtsZ polymers by 202E

圖4 化合物 202E與 FtsZ的對接結(jié)果（化合物 202E以桿狀結(jié)構(gòu)表示，參與小分子相互作用的氨基酸標注氨基酸編號，紅色表示氫鍵。A：化合物 202E對接入 FtsZ的位置；B：化合物 202E與 FtsZ形成的鍵）Figure 4 Docking result of compound 202E and FtsZ（Compound 202E was shown in rod structure.The interaction amino acids were labeled with serial number.Hydrogen bond was indicated with red.A:The position of compound 202E inserted into FtsZ；B: The bonds of compound 202E and FtsZ）

3 討論

本實驗利用已建立的結(jié)核分枝桿菌 FtsZ抑制劑的篩選模型篩選抗結(jié)核先導化合物，得到一個陽性化合物 202E。202E可以在酶水平抑制結(jié)核分枝桿菌 FtsZ的 GTP酶活性，也可以在蛋白水平抑制 FtsZ的聚合。分子對接顯示，202E可以與 FtsZ蛋白的 GTP結(jié)合位點形成相互作用鍵，阻礙 FtsZ 與 GTP結(jié)合之后發(fā)揮生物學功能?；钚曰衔?02E未在之前的文獻中報道有抗結(jié)核活性。

Discovery Studio（簡稱 DS）是新型的以生物大分子、有機小分子為主要研究對象的專業(yè)分子模擬與設(shè)計軟件。主要功能包括：同源建模、分子動力學模擬、基于結(jié)構(gòu)藥物設(shè)計工具（包括配體-蛋白相互作用、全新藥物設(shè)計和分子對接）、基于小分子的藥物設(shè)計工具（包括定量構(gòu)效關(guān)系、藥效團、數(shù)據(jù)庫篩選、ADMET），應(yīng)用學科涵蓋生命科學、組合化學、藥物化學、計算化學等。分子對接就是把配體分子放在受體活性位點的位置，然后按照幾何互補、能量互補以及化學環(huán)境互補的原則來實時評價配體與受體相互作用的好壞，并找到兩個分子之間最佳的結(jié)合模式。新藥的研發(fā)是一個漫長的過程，如果每一個新化合物都進行藥理實驗研究，將浪費很多的人力、物力、財力。計算機輔助藥物設(shè)計的建立，開拓了新的藥物研究領(lǐng)域和方法，從分子水平研究藥物與受體的相互作用。為后續(xù)實驗研究提供重要的信息，使實驗研究具有較強的導向性［9-10］。

本研究為以 FtsZ為靶點的抗結(jié)核藥物研究提供了較好的分子探針。在后續(xù)實驗中，會進一步測定活性化合物的抗結(jié)核作用和對其他微生物的抗菌作用，以及開展體內(nèi)、外藥效學研究。我們還將對活性化合物繼續(xù)進行結(jié)構(gòu)改造，進行深入的構(gòu)效關(guān)系、分子藥理學研究，以期獲得結(jié)構(gòu)新穎、效果顯著的新型抗結(jié)核藥物先導物。

［1］ Lin Y，Li Y，Zhu Y，et al.Identification of antituberculosis agents that target ribosomal protein interactions using a yeast two-hybrid system. Proc NatlAcad Sci U S A，2012，109（43）:17412-17417.

［2］ Osborne R.First novel anti-tuberculosis drug in 40 years.Nat Biotechnol，2013，31（2）:89-91.

［3］ Scheffers DJ，Driessen AJ.Immediate GTP hydrolysis upon FtsZ polymerization.Mol Microbiol，2002，43（6）:1517-1521.

［4］ Margalit DN，Romberg L，Mets RB，et al.Targeting cell division: small-molecule inhibitors of FtsZ GTPase perturb cytokinetic ring assembly and induce bacterial lethality.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（32）:11821-11826.

［5］ Dasgupta D.Novel compound with potential of an antibacterial drug targets FtsZ protein.Biochem J，2009，423（1）:e1-e3.

［6］ Kapoor S，Panda D.Targeting FtsZ for antibacterial therapy:a promising avenue.Expert Opin Ther Targets，2009，13（9）:1037-1051.

［7］ Lin Y，Zhu N，Han Y，et al.Identification of anti-tuberculosis agents that target the cell-division protein FtsZ.J Antibiot（Tokyo），2014，67（9）:671-676.

［8］ Kalyaanamoorthy S，Chen YP.Structure-based drug design to augment hit discovery.Drug Discov Today，2011，16（17-18）:831-839.

［9］ Simmons KJ，Chopra I，F(xiàn)ishwick CW.Structure-based discovery of antibacterial drugs.Nat Rev Microbiol，2010，8（7）:501-510.

［10］Ekins S，Bradford J，Dole K，et al.A collaborative database and computational models for tuberculosis drug discovery.Mol Biosyst，2010，6（5）:840-851.

Methods By using the high-throughput screening model for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ，compound 202E was selected.We assessed the IC50value and molecular level activity of 202E.And then we docked compound 202E with active site of FtsZ.

Results Compound 202E was found to inhibit GTPase activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ with IC50of 15.46 μmol/L. 202E also reduce the polymers of FtsZ.Molecular docking showed that 202E bound to the GTP site of FtsZ and inhibited the GTPase activity of FtsZ.

Conclusion Compound 202E is a promising lead for inhibitors of Mycobacterium tuberculosis FtsZ.

Screening and activity of Mycobacterium tuberculosis FtsZ inhibitors

LIN Yuan，ZHU Ning-yu，JIANG Jian-dong，SI Shu-yi

Objective The aim of the study is to find new anti-tuberculosis agents which can inhibit the activity of FtsZ in Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis；Enzyme inhibitors；FtsZ

SI Shu-yi，Email:sisyimb@hotmail.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2015.02.003

國家自然科學基金（81302816）

100050北京，中國醫(yī)學科學院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點實驗室（林媛、蔣建東）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家新藥（微生物）篩選實驗室（朱寧嶼、司書毅）

司書毅，Email：sisyimb@hotmail.com

2014-09-02

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2015，10（2）:109-112

Author Affiliations:Institute of Materia Medica（LIN Yuan，JIANG Jian-dong），Institute of Medicinal Biotechnology（ZHU Ning-yu，SI Shu-yi），ChineseAcademy of Medical Sciences&Peking Union Medical College，Beijing 100050，China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2015，10（2）:109-112