許鵬唐 鄭雅 陸陽 周廣東 劉偉 曹誼林 張文杰

骨髓單個核細胞與骨髓間充質干細胞促進大鼠皮瓣存活率的比較

許鵬唐 鄭雅 陸陽 周廣東 劉偉 曹誼林 張文杰

目的比較來源于等量骨髓的單個核細胞與經擴增的間充質干細胞，促進大鼠隨意皮瓣成活率的效果。方法取等質等量的大鼠骨髓，一半直接離心獲得骨髓單個核細胞，一半經體外培養(yǎng)獲得骨髓間充質干細胞，注射相等數(shù)量（n=6）的大鼠隨意皮瓣。術后測量并計算皮瓣成活面積，取材，行組織學檢測，計數(shù)CD31陽性血管數(shù)量。結果未經培養(yǎng)的骨髓單個核細胞組皮瓣的平均存活率為（71.6±8.4）%，培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞組平均存活率為（66.2±3.1）%，這兩組存活率均顯著高于注射平衡液的對照組（55.9±3.4）%；注射細胞組之間平均存活率沒有統(tǒng)計學差異。組織學血管密度計數(shù)顯示，骨髓單個核細胞組和骨髓間充質干細胞組的微血管數(shù)量分別是（58.2±6.8）和（42.7±5.1），都顯著高于PBS對照組（22.8±3.1），而骨髓單個核細胞組也顯著高于骨髓間充質干細胞組。結論與不經培養(yǎng)的骨髓單個核細胞相比，通過體外擴增的骨髓間充質細胞，未能顯著提高大鼠隨意皮瓣的成活率。

隨意皮瓣細胞治療骨髓單個核細胞骨髓間充質干細胞

doi∶10.3969/j.issn.1673-0364.2015.02.011

隨意皮瓣的游離端易壞死，因此在使用中其長寬比例收到限制，一般為1.5∶1～2∶1。應用交感神經藥物、鈣通道阻滯劑、血管擴張藥物等，可以改善皮瓣的壞死情況[1-2]，但是全身高劑量應用這些藥物會帶來很多副作用。研究證實，血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（b-FGF）、轉化生長因子β（TGF-β）等生長因子，可以改善皮瓣的壞死情況[3-5]，但應用受到短暫半衰期的限制。

近年來，在組織再生與修復重建領域，干細胞的應用受到了廣泛關注。通過離心骨髓獲得的骨髓單個核細胞（BM-MNCs）和通過體外培養(yǎng)獲得的骨髓間充質干細胞（BMSCs），都被證明可以促進皮瓣的成活[6-7]。理想的狀態(tài)是抽取少量的骨髓，在不丟失干細胞干性的前提下，通過體外培養(yǎng)獲得大量的BMSCs來滿足臨床應用的需要。但是，隨著體外培養(yǎng)代次的增加，細胞的表型和功能都會有所改變。因此，我們比較來源于等質等量骨髓的BM-MNCs和BMSCs對大鼠隨意皮瓣成活率的促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器

Wistar雄性大鼠若干，由上海西普爾-必凱公司提供，依照實驗動物保護指南，所有動物都獲得人道主義對待。

胎牛血清（HyClone公司，美國）；低糖DMEM（Invitrogen公司，美國）；Ficoll液（Sigma公司，美國）；胰蛋白酶（Sigma公司，美國）；FITC或PE標記的抗大鼠CD29、CD90、CD45抗體（BD公司，美國）；抗大鼠CD14、CD133、CD144、CD31、CD34、KDR一抗和FITC或PE標記的相應二抗（Abcam公司，英國）；攜辣根過氧化物酶的羊抗小鼠二抗（Abcam公司，英國）；DAB顯色劑（Dako公司，丹麥）；石蠟切片機（Thermo公司，美國）；流式細胞儀（BD公司，美國）。

1.2 BM-MNCs的分離

BM-MNCs的分離方法參照文獻[7]。頸椎脫臼法處死3周大的Wistar雄性大鼠，75%乙醇浸泡消毒10 min，取下雙側股骨和脛骨，剪開長骨的兩端，注射器吹出骨髓腔中的骨髓，重懸在含10%胎牛血清的低糖DMEM中。10m L骨髓重懸液加入到3m L的Ficoll液上，密度梯度離心后，分4層，抽取第2層“云霧狀”的細胞層，重懸在PBS中備用。

1.3 BMSCs的分離及培養(yǎng)

骨髓獲取方法同上。分離及培養(yǎng)方法參照文獻[8]。骨髓重懸液按照1只大鼠的骨髓量接種1個10 cm培養(yǎng)皿，放置在含5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。2~3 d換液一次，去掉不貼壁的血液細胞，6~7 d待細胞長滿90%左右傳代。之后3~4 d用0.25%胰蛋白酶消化傳代，傳代至第4代，重懸于PBS中備用。

1.4 流式細胞術檢測BM-MNCs和BMSCs的表型

收集新鮮分離的BM-MNCs和第4代的BMSCs，配置含4%胎牛血清的PBS緩沖液。200μL緩沖液重懸5×105個細胞，加入到EP管中并作標記。每個EP管中分別加入1μL FITC結合的抗CD29抗體和抗CD90抗體，1μL PE結合的抗CD45抗體，1μL抗CD14、抗CD133、抗CD144、抗KDR、抗CD31、抗CD34的一抗，4℃條件下孵育30min，期間每10 min搖晃一次。孵育后，PBS緩沖液清洗3次，加入FITC或PE標記的相應的二抗繼續(xù)在4℃條件下孵育30min，孵育后，PBS緩沖液清洗3次。所有標記好的樣本重懸成100μL，待上機。

1.5 隨意皮瓣模型的建立和細胞移植

選取體質量為200~250 g的Wistar雄性大鼠，按照0.4m L/100 g的劑量腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，備皮。手術前2 d（-2 d），把細胞懸液按7個點平均注射在大鼠背部皮下。手術當天（0 d），以髂前上棘連線為蒂部在大鼠背部切取一個長8 cm、寬2 cm的隨意皮瓣。切取后，用3-0的絲線原位縫合。術后第7天，測量隨意皮瓣的成活面積[9]。

為了確定有效的細胞移植劑量，新鮮分離一定數(shù)量的BM-MNCs，分別以1×106和5×106的BMMNCs注射兩組隨意皮瓣模型（n=6），同樣劑量的PBS注射作為對照組（n=6）。在術后7 d測定各組的隨意皮瓣存活面積，以此確定后期實驗每只大鼠模型注射5×106個細胞是合適的細胞劑量。

為了比較來源于等質等量骨髓的BM-MNCs和BNSCs的治療效果，抽取4只Wistar雄性大鼠的骨髓并平均分成兩份，一份用于直接密度梯度離心分離BM-MNCs，一份用上述的全骨髓貼壁培養(yǎng)方法獲得第4代的BMSCs。第一步：計數(shù)收集到的BMMNCs個數(shù)，按照（BM-MNCs數(shù)）/（5×106）計算出可注射大鼠的數(shù)量。第二步：計數(shù)培養(yǎng)到第4代的BMSCs個數(shù)，按照（BMSCs數(shù)/第一步計算出的可注射大鼠數(shù)量）計算出每一只大鼠接受的細胞劑量。第三步：5×106的BM-MNCs和相對應數(shù)量的BMSCs重懸于700μL的PBS中，注射到大鼠模型的皮下，每只鼠注射7個點，每個點注射100μL細胞懸液，每組6只鼠，對照組注射等量的PBS（n=6）。

1.6 隨意皮瓣成活率的檢測

皮瓣手術后第7天，麻醉大鼠模型，數(shù)碼相機拍攝皮瓣成活的大體情況，觀察其外觀、顏色、質地，以Image-Pro Plus 6.0軟件分析隨意皮瓣的成活面積，結果計算（成活面積/皮瓣面積×100%）。

1.7 組織學檢測

術后第7天，過量麻醉法處死大鼠，在隨意皮瓣長軸的中部取樣，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切取6μm厚石蠟切片，根據標準的免疫組化過程，4℃孵育小鼠抗大鼠CD31抗體過夜，第二天37℃孵育攜過氧化氫酶的羊抗小鼠二抗30 min，隨后在光鏡下DAB顯色液顯色。分別在200倍光鏡下對每張石蠟切片隨機選取5個視野拍照，計數(shù)每張照片中的微血管數(shù)量，取平均值為樣本的微血管數(shù)量。

1.8 數(shù)據分析

2 結果

2.1 BM-MNCs和BMSCs的鑒定

培養(yǎng)到第4代的BMSCs呈現(xiàn)出典型的成纖維細胞樣形態(tài)，在體外有很強的增殖能力，能夠在特定條件下被誘導成脂、成骨、成軟骨等。流式細胞術分析顯示，與BM-MNCs相比，BMSCs高表達間充質干細胞標志物CD29和CD90，低表達內皮細胞的標志物CD31和造血細胞標志物CD45（圖1、表1）。

圖1 流式細胞術檢測骨髓單個核細胞和骨髓間充質干細胞的表面標志物表達Fig.1 The cell surfacem arker expression p rofile of BMM NCs and BMSCs by flow cytom etry

表1 BM-MNCs和BMSCs各表面標志物的表達情況Table 1 The cell surfacemarker expression profile of BM-MNCsand BMSCs

2.2 確定有效的細胞移植劑量

為了確定有效的細胞移植劑量，分別向隨意皮瓣模型中注射1×106或5×106新鮮分離的BMMNCs。制作皮瓣模型術后7 d，皮瓣上出現(xiàn)了明顯的成活和壞死分界（圖2A）。1×106細胞治療組的平均皮瓣存活率是（64.0±6.1）%，5×106細胞治療組的平均皮瓣存活率是（70.8±5.3）%，均顯著高于PBS對照組的存活率（54.3±2.5）%，P＜0.05；細胞治療組間沒有明顯的統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2B）。由此確定每只大鼠注射5×106，作為后續(xù)實驗移植劑量。

圖2 確定細胞移植的有效劑量Fig.2 The identification of optim al cell dose for therapy

2.3 移植BM-MNCs和BMSCs促進皮瓣成活

BM-MNCs治療組和BMSCs治療組的皮瓣成活率分別為（71.6±8.4）%和（66.2±3.1）%，都顯著高于PBS對照組的皮瓣成活率（55.9±3.4）%，P＜0.05；骨髓單個核細胞治療組和骨髓間充質干細胞組之間沒有明顯的統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖3）。

圖3 BM-MNCs和BM SCs治療效果的比較Fig.3 The com parison of the theraputic effective of BM-MNCs and BMSCs

圖4 皮瓣微血管密度（*：P＜0.05；標尺：100μm）Fig.4 Capillary density in skin flapsmeasured (*:P＜0.05;Scale bars:100μm)

2.4 隨意皮瓣的微血管密度

為計數(shù)細胞移植后皮瓣的微血管密度，對取下的標本行CD31染色。結果顯示，BM-MNCs組和BMSCs組的微血管數(shù)量分別是（58.2±6.8）和（42.7±5.1），顯著高于PBS對照組（22.8±3.1），P＜0.05。另外，BMMNCs組也顯著高于BMSCs組（P＜0.05）（圖4）。

3 討論

BM-MNCs和BMSCs的成血管潛能在前期的皮瓣模型和其他缺血性疾病中都有報道[6－7,10-14]。然而，哪一種細胞更適合臨床應用還不明確。體外培養(yǎng)擴增骨髓細胞可以減少初始抽吸骨髓的量，但會隨著培養(yǎng)代次的增加喪失一些細胞的功能，并且長期培養(yǎng)可能會帶來一些安全問題。因此，有必要明確體外培養(yǎng)骨髓是否能夠給臨床治療帶來更多的好處。本研究發(fā)現(xiàn)，BM-MNCs和BMSCs都可以促進大鼠隨意皮瓣的成活率。更重要的是，注射了劑量相當?shù)膩碓从诘荣|等量骨髓的BM-MNCs和BMSCs，兩組皮瓣的成活率沒有顯著的統(tǒng)計學差異。這表明目前的骨髓細胞培養(yǎng)系統(tǒng)沒有給治療帶來幫助。

新生血管對于皮瓣缺血損傷后的存活具有重要作用。BMSCs已被用于治療許多缺血性疾病[15-18]，其機制主要是通過旁分泌一些生長因子來保護存留的細胞，促進細胞的增殖和血管的新生，并調控炎癥反應[19-22]。研究表明，BMSCs有可能直接參與新血管的形成[23-24]。與BM-MNCs相比，BMSCs是相對純化的細胞，可能有益于減少細胞相關的副作用。然而，其他的成血管成分（比如內皮祖細胞和造血細胞）[25]在培養(yǎng)的過程中會逐漸丟失（圖2）。這可能是純化后的BMSCs與BM-MNCs相比，不具有治療上的優(yōu)勢的原因。

干細胞培養(yǎng)中的一個挑戰(zhàn)就是在培養(yǎng)過程中維持其“干性”。目前標準的BMSCs的培養(yǎng)過程被廣泛應用，但并不完美[25-26]。有報道認為，細胞在后續(xù)的培養(yǎng)過程中丟失了其多向分化潛能[25]。在本研究中，培養(yǎng)到第4代的BMSCs仍然具有多向分化潛能。與其他類似的研究相比，本研究采用的細胞注射劑量高于其他研究[7，27-30]，但實驗結果顯示，BMSCs組并不優(yōu)于BM-MNCs組。

綜上所述，我們認為，BM-MNCs和BMSCs都可以促進大鼠隨意皮瓣的成活率。但是，相比之下，BM-MNCs具為方便、快捷，效果更優(yōu)，更符合臨床應用的要求?；蛟S，隨著BMSCs培養(yǎng)體系的進一步優(yōu)化，經過培養(yǎng)擴增的BMSCs能更好地維持其“干性”，能在今后的應用中獲得優(yōu)勢地位，從而取代BM-MNCs。

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Com parison between Bone M arrow-derived Mononuclear Cells and M esenchymal Stem Cells in Promoting Survival Rates of Random-pattern Skin Flap in Rats

XU Peng,TANG Zhengya,LU Yang,ZHOU Guangdong,LIU Wei,CAO Yilin,ZHANGWenjie.Departmentof Plastic and Reconstructive Surgery,ShanghaiNinth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;National Tissue Engineering CenterofChina,Shanghai200241,China.Correspondingauthor:ZHANGWenjie(E-mail:wenjieboshi@aliyun.com).

Objective To compare the non-cultured bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)and cultured bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)in the promotion of random-pattern skin flap survival of rats.M ethods BMMNCs and BMSCs derived from two identical rat bonemarrow aspirateswere injected in a random-pattern skin flap model of rat(n=6).The survival areawas determined by its appearance,color and texture.Capillary density of flapswasmeasured by histology.Results The flap survival rates were(71.6±8.4)%in the BM-MNC-treated group and(66.2±3.1)%in the BMSC-treated group,both ofwhich were significantly higher than the control group(55.9±3.4)%.However,no significant difference was observed between the cell transplanted groups.According to vessel density assay,capillary density in the BM-MNC-treated group(58.2±6.8)was higher than in the BMSC-treated group(42.7±5.1),both ofwhich were significantly higher than the control group(22.8±3.1).Conclusion Pre-culture of BMSCs does not bring therapeutic benefits.

Random-pattern skin flap;Cell therapy;Bonemarrow mononuclear cells; Bonemarrow mesenchymal stem cells

Q813.1+1

A

1673－0364（2015）02－0090－05

2015年2月3日；

2015年3月1日）

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（“973”項目）（2011CB964704）；國家自然科學基金（81271714，31170944）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科，上海市組織工程研究重點實驗室；200241上海市組織工程國家工程中心。

張文杰（E-mail：wenjieboshi@aliyun.com）。