鄧潔雄 盧訊聰 顏惠芳

（1廣東省廣州市藥品檢驗(yàn)所四分所，廣州510405；2廣東省漢古中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，廣州510000）

枸杞子極性成分HPLC指紋圖譜的研究

鄧潔雄1盧訊聰1顏惠芳2

（1廣東省廣州市藥品檢驗(yàn)所四分所，廣州510405；2廣東省漢古中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院，廣州510000）

目的建立枸杞子藥材極性成分的高效液相（HPLC）指紋圖譜。方法以迪馬Kromasil C18為色譜柱，流動(dòng)相：乙腈-0.8%甲酸，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢驗(yàn)波長(zhǎng)254 nm，洗脫時(shí)間60 min。結(jié)果建立了枸杞藥材極性成分的HPLC指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了13個(gè)共有峰，寧夏5個(gè)產(chǎn)地相似度在0.97以上，其他產(chǎn)地枸杞藥材相似度較差，河北青龍相似度僅有0.305。結(jié)論建立的枸杞指紋圖譜可為枸杞質(zhì)量控制及道地性研究提供一定的參考依據(jù)，寧夏中寧作為枸杞道地產(chǎn)區(qū)有一定科學(xué)性。

枸杞；高效液相色譜；指紋圖譜；極性成分

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。具有滋補(bǔ)肝腎，益精明目的作用，可用于虛勞精虧，腰膝酸痛，眩暈耳鳴，內(nèi)熱消渴，血虛萎黃，目昏不明等癥狀［1］。研究表明，枸杞主要活性成分為多糖、黃酮類和生物堿等［2］，其中大部分為極性成分。中藥化學(xué)成分復(fù)雜，單對(duì)某個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定難以確保其科學(xué)性，中藥指紋圖譜可進(jìn)行多指標(biāo)、客觀、綜合的評(píng)價(jià)，能更全面反映中藥成分的全貌，是目前確保中藥質(zhì)量穩(wěn)定、可控的一種有效手段，是中藥標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)容之一。目前，有學(xué)者建立枸杞黃酮類化合物、多糖［3-4］的高效液相（HPLC）指紋圖譜，枸杞極性化合物為其有效部位，其HPLC指紋圖譜未見報(bào)道。本研究采用HPLC建立枸杞子極性部位指紋圖譜，旨在為其建立一套科學(xué)可行的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)方法，保證枸杞子有效性和道地性。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent-1100高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣器，在線脫氣，四元泵）（美國(guó)安捷倫公司）；KQ-300VDB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；A4DL型自動(dòng)純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)0720-9807）；10批枸杞子藥材分別采集于寧夏、新疆、甘肅、內(nèi)蒙古、河北等地（見表1），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實(shí)；乙腈為色譜純（美國(guó)Burdick＆Jackson公司），甲酸等其他試劑均為分析純，水為超純水。

表1 10批枸杞子藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件色譜柱：迪馬Kromasil C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.8%甲酸，流動(dòng)相B：乙腈，梯度洗脫條件：0～30 min（7%～18%B），30～50 min（18%～28%B），50～60 min（28%～50%B）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢驗(yàn)波長(zhǎng)：254 nm。

2.2 對(duì)照品的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品適量，置入25mL量瓶，甲醇液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.052 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液。

2.3 供試品的制備取本品粗粉約5 g，精密稱定，置入500 mL錐形瓶，加95%乙醇200 mL，冷浸處理12 h，濾出冷浸液，藥渣按照上述步驟重復(fù)操作2次，合并冷浸液，于50℃減壓旋蒸蒸干，殘?jiān)?0 mL水溶解，石油醚（60～90℃）萃取3次，每次50 mL，棄去醚層，水層用正丁醇萃取3次，每次50 mL，合并正丁醇層，水浴80℃蒸干，殘?jiān)铀?5 mL溶解，抽濾，濾液上聚酰胺柱。150 mL水洗脫，棄去洗脫液，再用125 mL 30%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴80℃揮干，殘?jiān)舆m量30%乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL量瓶，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.4 測(cè)定方法精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件記錄60 min色譜圖。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察精密吸取同一供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次。13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.85%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.6%，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.5.2 穩(wěn)定性考察分別取同一供試品溶液，按2.3項(xiàng)方法提取，采用上述HPLC條件，分別于0，4，8，16，24 h進(jìn)樣測(cè)定。13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.78%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.48%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重現(xiàn)性考察取同一批枸杞子藥材樣品5份，按2.3項(xiàng)供試品溶液制備方法操作，依2.1項(xiàng)條件分別進(jìn)樣。13個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.85%，相對(duì)峰面積的RSD均小于2.6%，符合指紋圖譜技術(shù)規(guī)定。

2.6 枸杞指紋圖譜的建立

2.6.1 共有峰建立及標(biāo)定經(jīng)對(duì)照品的HPLC圖譜定位，8號(hào)峰為蘆丁峰。實(shí)驗(yàn)選擇8號(hào)峰（蘆?。閰⒄辗?，其相對(duì)保留時(shí)間和峰面積為1，計(jì)算各共有指紋圖譜的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積比值（見表2、表3）。10批枸杞標(biāo)定了13個(gè)共有峰，占總峰面積的83.6%，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于2.12%，重現(xiàn)性好，而各共有峰的相對(duì)峰面積值差別較大，可用于鑒別和區(qū)分不同來源的枸杞子藥材。

2.6.2 指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)采用中藥色譜指紋圖譜相似度軟件（2004A版），處理10批不同產(chǎn)地供試品HPLC圖譜，生成對(duì)照指紋圖譜，以此為參照計(jì)算出10批藥材相似度；同時(shí)以道地產(chǎn)區(qū)寧夏中寧枸杞（S1）為參照，計(jì)算其他9批藥材相似度（見表4）。結(jié)果表明，以寧夏中寧枸杞（S1）為參照，寧夏5個(gè)產(chǎn)地的枸杞相似度較好，其他5個(gè)產(chǎn)地相似度較差，河北青龍產(chǎn)枸杞子藥材相似度僅有0.305。

表2 不同產(chǎn)地枸杞子指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 不同產(chǎn)地枸杞子指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積

表4 10批枸杞子樣品HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

圖1 枸杞子HPLC指紋圖譜

3 討論

枸杞子中的極性成分主要為黃酮類，根據(jù)其化學(xué)特性，考察甲醇、95%乙醇、水和正丁醇4種溶劑提取效果，以95%乙醇提取物的出峰數(shù)最多，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，采用石油醚脫脂和聚酰胺洗脫等方法純化枸杞極性成分。同時(shí)實(shí)驗(yàn)比較了超聲提取法、回流提取法和冷浸法提取效果，以冷浸法效果較佳。

實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行考察，比較了乙腈-水，乙腈-0.1%磷酸，乙腈-0.5%甲酸3種流動(dòng)相，其中以乙腈-0.5%甲酸為流動(dòng)相，色譜峰峰形對(duì)稱，分離度高，但峰展寬較大。經(jīng)過進(jìn)一步優(yōu)化，在乙腈-0.8%甲酸條件下，峰展寬明顯變小。實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）于200～600 nm范圍掃描，樣品液在254 nm處有最大吸收。同時(shí)實(shí)驗(yàn)對(duì)色譜柱、梯度洗脫條件、流速、柱溫等條件進(jìn)行了考察，優(yōu)選出最佳的色譜條件。

自古以來，寧夏中寧枸杞因色艷、粒大、皮薄、肉厚、籽少、甘甜而被奉為道地藥材，但近年新疆、河北、內(nèi)蒙等地枸杞種植面積增大，產(chǎn)量明顯增多，其品質(zhì)是否與寧夏枸杞一致，有必要進(jìn)行科學(xué)考證。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC建立不同產(chǎn)區(qū)枸杞的指紋圖譜，建立枸杞特征指紋圖譜峰，評(píng)價(jià)其相似度，鑒別枸杞內(nèi)在質(zhì)量，闡述枸杞不同產(chǎn)地的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分及含量有一定差異，而寧夏5個(gè)產(chǎn)地枸杞子在HPLC圖譜的峰數(shù)、大小基本一致，相似度較好，說明寧夏中寧作為枸杞道地產(chǎn)區(qū)有一定科學(xué)性。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:232.

［2］江旭鋒.枸杞子化學(xué)成分及其藥理學(xué)研究概況［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，25（3）:98-100.

［3］張自萍，廖國(guó)玲，李弘武.寧夏枸杞黃酮類化合物HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2008，29（1）:103-105.

［4］蔣梅，譚麗蓉，黃曉潔.枸杞子多糖柱前衍生HPLC指紋圖譜分析［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（22）:53-56.

Research on Polar Components of Lycium Barbarum L.by HPLC Fingerprint

DENGJiexiong1，LU Xunchong1，YANHuifang2
（1.Thefourthbranchof GuangzhouInstituteforDrugControl，Guangzhou510405，China；2.HAN-GU TraditionalChineseMedicineInnovationResearchInstitute，Guangzhou510000，China）

Objective To establish a method for HPLC-fingerprint of polar components of Lycium barbarum L.Methods Using the methods of HPLC to establish the fingerprint for R．a(chǎn)coniti from different areas，Dikma Kromasil C18 column was used at 25℃，acetonitrile-0.8%formic acid as mobile phase，gradient eluting，flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was set at 254 nm and eluting period was 60 min.Results HPLC-fingerprint of Lycium barbarum L.in different areas was established，which contained 13 common peaks，and the similarity were over 97%in five batches of herbal medicine from Ningxia，there are some differences in the of other origin，Hebei Dragon similarity is only 0.305.Conclusion Established fingerprint could be used for quality control and reference genuineness for the genuineness of Lycium barbarum L.，there was a certain scientific for genuineness area in Zhongning.

Lycium barbarum L.；HPLC；chromatographic fingerprint；polar components

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.15.072

1672-2779（2015）-15-0142-03

：楊杰本文校對(duì)：楊杰

2015-06-25）