郭大志，劉懌君，潘樹義，何 成，段樹民

·神經疾病·

光刺激體外培養(yǎng)的NG2細胞對海馬神經元內Ca2＋活性和電活動的影響

郭大志，劉懌君，潘樹義，何 成，段樹民

目的 觀察選擇性光刺激NG2細胞對海馬神經元內Ca2＋活性和電活動的影響，并初步探討可能的作用機制。方法 體外純化培養(yǎng)新生SD大鼠NG2細胞，通過脂質體轉染的方法，在NG2細胞中特異性表達光敏感通道(channelrhodopsin-2，ChR2)蛋白DNA，并與體外培養(yǎng)7 d的海馬神經元共培養(yǎng)48 h，采用藍光(470 nm、5 s、5 mW/cm2)選擇性刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞，利用Ca2＋成像和電生理的方法記錄NG2細胞周圍海馬神經元中的Ca2＋濃度變化和電流改變情況，同時比較加入/未加入γ-氨基丁酸A型受體抑制劑情況下神經元的電流變化特點。結果 當藍光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞后，首先NG2細胞內的Ca2＋信號增強，隨后其周圍海馬神經元內的Ca2＋升高約20%；Ca2＋緩慢下降后再次出現(xiàn)一個Ca2＋峰，幅度較第1次??；NG2細胞周圍海馬神經元的電流頻率增加，振幅增大。而當預先在細胞外液中加入50 μmol/L γ-氨基丁酸A受體抑制劑后，海馬神經元的電流頻率和振幅較未加抑制劑組明顯減小(P＜0.05)。結論 選擇性光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞可使其興奮，且可能通過釋放γ-氨基丁酸來調節(jié)神經元活動。

NG2細胞；光敏感通道；神經元；γ-氨基丁酸

NG2細胞是中樞神經系統(tǒng)中一類新型膠質細胞，廣泛分布在成年哺乳動物的灰質和白質，占腦內全部膠質細胞的5%～10%，其功能至今未被完全闡明[1]。早期研究發(fā)現(xiàn)NG2細胞在體內和體外可分化發(fā)育為少突膠質細胞，故又稱其為少突膠質細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，NG2細胞不但可以分化為少突膠質細胞，還可以分化為星形膠質細胞和神經元[3-4]。此外，NG2細胞表達多種受體和離子通道，能夠產生類似神經元的“動作電位”及長時程增強(long time potentiation，LTP)[5-6]。因此，NG2細胞在中樞神經系統(tǒng)的發(fā)育和整合中發(fā)揮重要作用。本研究擬通過在體外純化培養(yǎng)的大鼠NG2細胞中轉染光敏感通道(channelrhodopsin-2，ChR2)蛋白，與大腦海馬神經元共培養(yǎng)，利用Ca2＋成像和電生理的方法，探討NG2細胞是否參與神經元活動的調節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 新生SD大鼠，由浙江大學動物中心[SCXK(浙)2007-2009]提供。

1.2 實驗設備、材料 500Ⅸ激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)、Fluoview 5.0采集分析軟件(日本Olympus公司)，恒溫振蕩器(華利達HI-9211KB，太倉市教課器材廠)，激光器和多功能電子定時器(中國科學院神經科學研究所)，四維機械微操縱器(SD-MX760，美國Burleigh公司)，培養(yǎng)皿(美國Corning公司)，多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL，美國Sigma公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(上海碧云天生物技術有限公司)，血清Opti-MEM培養(yǎng)基(伊格爾最低必需介質培養(yǎng)基改良型，美國Sigma公司)，孵育鈣熒光染料[Rhod-2，AM，阿拉丁試劑(上海)有限公司]，NG2多克隆抗體、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)α單克隆抗體、CD11b、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，美國Millipore公司)，Alexa Fluor 488標志山羊抗兔二抗、Cy3標志山羊抗小鼠二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 NG2細胞培養(yǎng) 參考文獻[7]方法略作修改。取新生SD大鼠腦，取出大腦皮質，0.125%胰蛋白酶，37℃，消化12 min、吹打成單細胞懸液，離心，以1×105/mL種植在預先鋪有PDL的75 cm2的培養(yǎng)瓶中。放入37℃、通95%空氣和5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中，每3 d換培養(yǎng)液。第10天時將培養(yǎng)瓶放置到搖床中200 r/min、37℃搖1 h，去除小膠質細胞。更換新膠質培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱平衡2 h，再將培養(yǎng)瓶放置到搖床中250 r/min、37℃搖16～18 h，收集培養(yǎng)液到無PDL包被的100 mm的培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱30 min，期間不時輕輕晃動。培養(yǎng)液收集離心后沉淀重懸，接種于PDL處理的玻片上，2 h換成純化OPCs培養(yǎng)基，貼壁細胞經免疫細胞化學染色鑒定，98%以上為OPCs細胞。

1.3.2 免疫熒光化學 OPCs細胞4%多聚甲醛于室溫固定10 min，0.2%的聚乙二醇辛基苯基醚破膜10 min，10%牛血清蛋白封閉1 h，一抗4℃孵育過夜磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗3遍后，加對應二抗(Alexa Fluor 488標志山羊抗兔二抗或Cy3標志山羊抗小鼠二抗)，在室溫下避光標志1 h，0.01 mol/L PBS洗3遍后。細胞圖像最后于倒置的激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3.3 脂質體轉染 按試劑說明書進行，將脂質體和DNA按2∶1(μL∶μg)比例分別加入150 μL的無血清Opti-MEM培養(yǎng)基，靜置5 min后將兩者混合，輕輕吹打混勻。放置20 min后加入含Opti-MEM 700 μL的培養(yǎng)皿，于37℃培養(yǎng)箱放置1.5 h，吸去液體后加入大鼠OPCs細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.4 藍光刺激 光源為氙燈，通過光纖將激光導出。激光器和多功能電子定時器相連，精確控制激光照射和關閉時間。光強通過功率計測定，470 nm，5 mW/cm2，光斑大小1 cm2。

1.3.5 Ca2＋成像 將純化培養(yǎng)并轉染ChR2蛋白的NG2細胞和體外純培養(yǎng)7 d的海馬神經元共培養(yǎng)48 h。在培養(yǎng)箱中孵育鈣熒光染料(5 μmol/L)20～30 min，0.01 mol/L PBS洗3遍。通過激光器發(fā)射藍光照射(470 nm、5 mW/cm2)，使用激發(fā)光譜為543 nm的共聚焦顯微鏡適時掃描細胞內鈣信號的變化(× 60水鏡)。為防止熒光強度的淬滅，掃描時激光強度不超過0.5%。

1.3.6 電生理記錄 使用Axon 700A放大器采集，Clampex 8.0軟件進行記錄。電極尖端入水前，輕輕推動注射器在電極內給一個正壓。在電壓鉗模式下用四維機械微操縱器引導充有電極內液的玻璃微電極。待電極尖端靠近細胞后，釋放掉正壓并順勢用嘴給一個負壓，同時慢慢將鉗制電壓調節(jié)到－70 mV。待形成高阻封接(＞1 G Ω)之后，給予快速有力的負壓使電極尖端下的細胞膜破裂，從而形成全細胞記錄模式。在gap-free模式下，比較加入/未加入γ-氨基丁酸(gamma-amino-butyric acid，GABA)A型受體抑制劑情況下，藍光刺激后表達ChR2蛋白的NG2細胞周圍海馬神經元的電流變化。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用GraphPad Prism 5軟件，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用Student's t檢驗法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NG2細胞免疫組化鑒定 NG2細胞純化培養(yǎng)貼壁生長1～2 d后，NG2抗體陽性細胞數(shù)可達到95%以上，細胞胞體直徑很小(＜10 μm)，且呈現(xiàn)比較典型的“雙極”或“多極”突起的形態(tài)，不表達星形膠質細胞特異標志物GFAP和小膠質細胞特異標志物CD11b(圖1)。

圖1 體外純化培養(yǎng)的大鼠NG2細胞鑒定

2.2 Ca2＋活性 光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞可誘導其周圍海馬神經元的Ca2＋活性升高(圖2)。當給轉染ChR2蛋白的NG2細胞藍光刺激(5 s、5 mW/cm2)后，首先出現(xiàn)NG2細胞內的Ca2＋信號增強，隨后其周圍海馬神經元內的Ca2＋升高約20%；Ca2＋緩慢下降后再次出現(xiàn)一個Ca2＋峰，幅度較第1次小。

2.3 神經元電活動 光刺激表達 ChR2蛋白的NG2細胞可調節(jié)神經元的電活動(圖3)，當給轉染ChR2蛋白的NG2細胞藍光刺激(5 s、5 mW/cm2)后，其周圍海馬神經元的電流頻率增加、振幅增大[藍光刺激組(234±10.5)pA，藍光未刺激組(132± 12.8)pA；n＝29，P＜0.05]。在細胞外液中加入50 μmol/L GABA A受體抑制劑Bicuculin，藍光刺激轉染ChR2蛋白的NG2細胞后，其周圍海馬神經元的電流頻率和振幅明顯減小[加抑制劑組(129±11.6) pA，無抑制劑組(234±10.5)pA；n＝29，P＜0.05]。

圖2 藍光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞誘導周圍海馬神經元的Ca2＋活性升高

圖3 光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞調節(jié)神經元的電活動

3 討論

NG2細胞被發(fā)現(xiàn)可分化為少突膠質細胞、Ⅱ型星形膠質細胞，故又叫Ⅱ型星形膠質細胞祖細胞、少突膠質細胞前體細胞或多形性細胞等[8]。在特定腦區(qū)，NG2細胞還可以分化為神經元[3]。越來越多的證據(jù)表明，NG2細胞在成年中樞神經系統(tǒng)的灰質和白質部位均勻分布，且無論從形態(tài)和電生理特性上均有別于星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞，目前被認為是中樞神經系統(tǒng)中的第4類膠質細胞[9]。迄今為止，NG2細胞的生理功能仍不清楚。電鏡研究發(fā)現(xiàn)，NG2細胞的胞體在海馬區(qū)、小腦、皮質等許多腦區(qū)與神經元密切相鄰，形成“突觸樣”結構。該結構與神經元突觸不同，“突觸”后致密帶不明顯，突觸前紐扣較小、囊泡較少[10]。電生理研究發(fā)現(xiàn)，成年海馬區(qū)、胼胝體和小腦等部位的NG2細胞突起與神經元軸突相靠近，接收神經元信號，其Na＋從細胞外流入細胞內，產生類似神經元動作電位的Spike[11-14]，甚至產生LTP[6]。這些研究提示，NG2細胞在成年腦內除具有前體細胞分化功能外，也可能參與神經網(wǎng)絡調節(jié)。Tanaka等[15]發(fā)現(xiàn)NG2細胞能夠釋放突觸調節(jié)物質，如腦源性神經營養(yǎng)因子，更進一步支持上述觀點。

ChR2蛋白在藻類中是一種光敏感通道蛋白，含315個氨基酸，構成7次跨膜結構，其中1個全反式視黃醛結合在蛋白核心部位，發(fā)揮光感受器的作用。當ChR2蛋白受到470 nm的藍光刺激后，其全反式視黃醛異構化，導致蛋白結構改變，通道開放(Na＋、Ca2＋通道)，陽離子進入細胞內，從而產生內向電流使細胞興奮[16]。ChR2蛋白的開放與關閉時間極短，達毫秒級，可用來刺激神經元穩(wěn)定發(fā)放動作電位，近年被廣泛用于研究神經元網(wǎng)絡、突觸可塑性相關功能及疾病的研究[17]。為探討NG2細胞興奮后是否影響神經元活動，本研究將轉染ChR2蛋白的NG2細胞制成單細胞懸液(轉染率25%左右)，與體外純化培養(yǎng)7 d的海馬神經元共培養(yǎng)48 h，利用光刺激技術特異性促使NG2細胞興奮，進行Ca2＋成像實驗，結果表明藍光刺激NG2細胞5 s(5 ms的脈沖、10 Hz)足以引起NG2細胞內Ca2＋濃度變化，進而誘發(fā)神經元內Ca2＋濃度升高，提示NG2細胞活性增加后可影響神經元活動。由于Ca2＋成像實驗過程中沒有加河豚毒素，沒有阻斷神經元的自發(fā)動作電位，故不排除第2個Ca2＋峰是由神經元興奮后的高反應性所致。

藍光刺激表達ChR2蛋白的NG2細胞興奮所需時間較表達ChR2蛋白的神經元要長，表明兩者細胞膜的電特性不同。有研究發(fā)現(xiàn)，NG2細胞膜的靜息電位與K＋平衡電位接近，約－100 mV，Na＋通道密度較K＋通道低[18]。提示NG2細胞很難像神經元一樣產生動作電位，故興奮性比神經元低。然而，NG2細胞表達Ca2＋通透的α-氨基-3羥基-5-甲基-異惡唑丙酸受體(開關時間30～500 ms)，正常條件下Ca2＋內流較少，但在某些條件下Ca2＋內流增加仍能誘導NG2細胞產生 Spike或 LTP[5-6]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NG2細胞表達代謝型P2Y1受體和離子型P2X7受體，ATP可通過作用于NG2細胞膜的這2種受體產生瞬時和長時程的Ca2＋反應[19]。因此，Ca2＋在NG2細胞興奮中發(fā)揮重要作用。根據(jù)本研究結果，藍光照射表達ChR2蛋白的NG2細胞，使細胞外的Ca2＋通過ChR2蛋白進入細胞內，誘導NG2細胞內的Ca2＋庫釋放，進一步激活NG2細胞膜表面的Ca2＋通透性受體，形成“正瀑布”效應。當達到NG2細胞膜去極化的“閾值”時，NG2細胞興奮發(fā)揮作用，最終影響其周圍海馬神經元的Ca2＋活性。這也能夠解釋為何NG2細胞需要長達5 s的藍光刺激才能引起神經元活動改變。由于擔心藍光強度過大會導致熒光淬滅或細胞死亡，本研究采用的光刺激強度較低，也可能是NG2細胞興奮所需時間較長的原因之一。

有研究表明，NG2細胞表達突觸蛋白synaptophysin——一種主要的突觸囊泡蛋白，提示NG2細胞可能有囊泡釋放神經物質的功能[20]。另有研究發(fā)現(xiàn)，大腦梨狀皮質部位的NG2細胞形似星形的中間神經元，可以分化為GABA能中間神經元，因此不除外NG2細胞具有釋放內源性抑制性神經遞質GABA的功能[3]。Ca2＋成像實驗結果提示，NG2細胞興奮可以影響神經元的細胞活動。那么NG2細胞是否對神經元的電活動有影響?本研究將轉染ChR2蛋白的NG2細胞與海馬神經元共培養(yǎng)48 h，采用全細胞膜片鉗技術，當對表達ChR2蛋白的NG2細胞進行藍光照射后，其周圍海馬神經元的電活動明顯增加，而預先孵育GABA A型受體抑制劑后，神經元電活動被明顯抑制，表明NG2細胞興奮可能通過向細胞外釋放GABA來調解神經網(wǎng)絡。目前，還沒有確切證據(jù)表明NG2細胞能夠釋放GABA作用于神經元，也不知道NG2細胞是否表達合成GABA所需的酶、運輸GABA的囊泡裝置以及GABA是如何釋放出NG2細胞，未來還需要進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，選擇性光刺激NG2細胞可使其興奮，且可能通過釋放GABA來調節(jié)神經元活性，進一步提示NG2細胞不但具有神經前體細胞的功能，還參與神經網(wǎng)絡的調控，可能在某些病理生理條件下發(fā)揮重要作用，成為未來治療脫髓鞘相關疾病的靶點。但本研究僅停留在體外細胞培養(yǎng)層面，而體內環(huán)境十分復雜，未來需進行腦片實驗對不同腦區(qū)的NG2細胞發(fā)揮的功能進一步闡明。

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Influence of Ca2＋and electrical activity in neurons of hippocampus by stimulating NG2 cells with blue light in vitro

GUO Dazhi1，LIU Yijun2，PAN Shuyi1，HE Cheng3，DUAN Shumin2
(1.Department of Hyperbaric Oxygen，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Institute of Neuroscience，Zhejiang University，Hangzhou Zhejiang 310058，China；3.Department of Neurobiology，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China)

Objective It has been investigated that the change of Ca2＋and electrical activity in neurons of hippocampus influenced by NG2 cells which expressed channelrhodopsin-2(ChR2) and were stimulated by blue light，and then discussed the probable mechanism.Methods We cultured NG2 cells from the cortex of neonatal rats，and transfected ChR2 DNA to NG2 cells through liposomes，then co-cultured NG2 cells expressed ChR2 protein with hippocampal neurons for 48 hours.By way of calcium imaging and electrophysiological recording，we could observe the change of calcium concentration and current in hippocampal neurons around the NG2 cells expressed ChR2 which were stimulated by blue light(470 nm，5 s，5 mW/cm2).Meanwhile，we compared the change of current in hippocampal neuron pre-adding inhibitor in extracellular fluid with no inhibitor. Results In calcium imaging experiment，we found that there was an elevation of Ca2＋concentration in NG2 cells expressed ChR2 as soon as the blue-light stimulus，and then Ca2＋concentration in neurons around NG2 cells increased by 20%，following a second Ca2＋peak which its amplitude was smaller than the first.In the electrophysiological experiment，we found that it was bigger of the frequency and amplitude of current in neurons around NG2 cells expressed ChR2 which were stimulated by blue light than those with no blue light.However，if we added γ-amino-butyric acid(GABA)A receptor inhibitor(bicuculin，50 μmol/L)in extracellular fluid in advance，the frequency and am-plitude of current in neurons around NG2 cells expressed ChR2 which were stimulated by blue light (5 s，5 mW/cm2)were significantly smaller than those with no inhibitor(P＜0.05).Conclusion Selective stimulating NG2 cells expressed ChR2 protein with blue light is able to excite NG2 cells and may regulate neural activity by releasing GABA.

NG2 cells；Channelrhodopsin-2(ChR2)；Neuron；Gamma-amino-butyric acid (GABA)

R338.1－332

A

2095-3097(2015)04-0208-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.04.005

2015-03-24 本文編輯:徐海琴)

國家自然科學基金項目(81401063)

100048北京，海軍總醫(yī)院高壓氧科(郭大志，潘樹義)；310058浙江杭州，浙江大學神經科學研究所(劉懌君，段樹民)；200433上海，第二軍醫(yī)大學神經生物學教研室(何 成)