張春燕，叢 梅，楊 文，于曉紅，徐洪濤

內(nèi)皮素-1在不同月齡大鼠神經(jīng)細胞中的表達

張春燕，叢 梅，楊 文，于曉紅，徐洪濤

目的 研究內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)在不同月齡大鼠神經(jīng)細胞中表達變化，為探討紋狀體易卒中機制、揭示腦血管病發(fā)病機制提供參考資料。方法 應用鏈霉親和素-生物素復合物免疫組化染色法觀測1～2個月齡、6～7個月齡及＞24個月齡3組共36只Wistar大鼠神經(jīng)細胞ET-1的表達。結果 隨大鼠月齡增加，ET-1在紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)表達增加，＞24個月齡組紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1陽性反應強度與其他2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，同月齡組紋狀體、顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)的ET-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論 ET-1在神經(jīng)系統(tǒng)的表達，可能與老年人易發(fā)生腦血管病有關。

神經(jīng)細胞；內(nèi)皮素-1；老化；大鼠

衰老是導致神經(jīng)系統(tǒng)退化性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病的主要危險因素，也是腦血管病發(fā)病率、病死率明顯增加的主要因素，而紋狀體又是腦血管意外最常發(fā)生的部位。內(nèi)皮素(endothelin，ET)是Yanagisawa等[1]從豬主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中分離純化出的一種具有強烈縮血管作用的生物活性肽。ET不能透過血腦屏障，而研究表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)節(jié)細胞中都有ET、ET mRNA的廣泛分布，故大腦中出現(xiàn)的ET只能是腦組織自身合成的[2]。ET-1作為強血管收縮因子，對于維持血管穩(wěn)態(tài)有著重要的作用[3]。ET-1表達異常與高血壓、動脈粥樣硬化、心血管病、腫瘤的發(fā)生有關[4-6]。內(nèi)皮素還與腦血管痙攣、腦缺血、腦梗死、腦出血的發(fā)生、發(fā)展有密切的關系。觀察隨著大鼠月齡增加ET-1在神經(jīng)細胞的變化規(guī)律，為揭示紋狀體易發(fā)生卒中的原因、臨床治療及腦血管病發(fā)病機制提供佐證。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康Wistar大鼠36只，雌雄不拘，按不同月齡分3組，第1組為1～2個月齡大鼠(80～120 g)、第2組為6～7個月齡大鼠(300～400 g)、第3組為＞24個月齡大鼠(450～600 g)，每組各12只。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化 用1%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，主動脈插管，生理鹽水灌注至流出液體變清亮，然后立即注入4℃的Zambonis固定液，灌注后將大鼠放入4℃冰箱1～2 h，取出腦組織移入20%蔗糖中，直至樣本沉入瓶底。冰凍切片(30 μm)收集在0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)備用。每個樣本隨機選取8張切片，根據(jù)鏈霉親和素-生物素復合物試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)染色步驟進行染色。鼠抗ET-1工作濃度1∶1 000(美國Sigma公司)；二抗生物素化抗鼠免疫球蛋白G，工作濃度1∶100(武漢博士德生物工程有限公司)；三抗鏈霉親和素-生物素復合物，工作濃度1∶100(武漢博士德生物工程有限公司)。對照組用正常山羊血清替代一抗反應。

1.2.2 染色 免疫組化染色判斷標準，無著色為陰性、淡黃色為弱陽性、棕黃色為中等陽性、深棕黃色為強陽性。所有切片，每張切片隨機選5個高倍視野(×200)進行攝片，計數(shù)免疫組化標志定位準確的陽性細胞占所有細胞的比例并記分。細胞質(zhì)或細胞核陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的25%以下為±、25%～49%為＋、50%～75%為＋＋、75%以上為＋＋＋，依次記為1、2、3、4分；染色強度弱陽性、中等陽性、強陽性依次以±、＋、＋＋表示，記為1、2、3分；最后計算2種記分的乘積。表達強度評分和觀察結果評分的乘積為表達強度。陽性表達判定標準為表達強度綜合得分＞4分[7]。除了檢測紋狀體ET-1免疫反應陽性細胞外，還對顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1反應強度進行了檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 10.0軟件，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

ET-1主要在細胞質(zhì)表達，隨著大鼠月齡的增加，紋狀體陽性細胞增多(圖1)，ET-1的表達也隨之增強。同月齡的大鼠腦不同部位ET-1表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。顳葉皮質(zhì)、海馬區(qū)ET-1的表達也隨著大鼠月齡的增加而增加。＞24個月齡組不同部位ET-1陽性反應強度與其他2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 3組大鼠神經(jīng)細胞ET-1免疫組化染色強度分值(分)

圖1 不同月齡大鼠紋狀體ET-1的表達(蘇木素染色，×400)

3 討論

ET-1由大內(nèi)皮素經(jīng)內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶裂解合成，是ET家族的主要成員之一，也是至今發(fā)現(xiàn)的最強的縮血管物質(zhì)，且作用持久。ET-1主要通過結合相應受體而發(fā)揮其生物學效應，其中ET-1 A受體對ET-1有較強的選擇性，主要分布于血管平滑肌，ET-1由內(nèi)皮細胞釋放后通過與ET-1 A受體的持久結合而調(diào)節(jié)血管的收縮[8]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理、生理情況下腦組織內(nèi)、腦脊液內(nèi)或血漿內(nèi)的ET-1增高，其受體表達也上調(diào)。提示ET系統(tǒng)不僅是正常生理情況下重要的血管活性肽及神經(jīng)調(diào)節(jié)肽，還在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理、生理過程中起重要作用。

老化是正常的生理過程，隨著大鼠月齡增加，紋狀體ET-1陽性反應強度增加，提示ET-1合成增加。導致ET-1陽性反應強度增加的原因很多，腦組織缺氧可能是主要因素之一。在正常情況下，ET-1可被內(nèi)皮細胞降解。內(nèi)皮細胞間的緊密連接可阻止ET-1從管腔內(nèi)漏出。因此，機體的自身調(diào)節(jié)機制可以維持ET的基礎釋放，適應生理功能的需要。ET-1在動脈高壓、慢性腎病、糖尿病患者以及實驗模型超表達。隨著增齡，ET-1在老年人循環(huán)血液中增加[9]，與本研究結果相一致。纖溶酶原激活物抑制劑、血管緊張素Ⅱ、凝血酶、自分泌刺激、pH減低會刺激ET-1釋放，雌激素、心房利鈉多肽、前列腺素、一氧化氮能抑制ET-1分泌，ET-1又可通過ET-1 A受體刺激血小板聚集促進血栓形成[10]。老齡大鼠神經(jīng)細胞ET-1表達增多，可能與老齡導致動脈硬化，腦組織相對血供減少有關。老年人出現(xiàn)腦血管病后組織損傷及臨床表現(xiàn)較年輕者重，可能與老齡ET-1在神經(jīng)細胞表達增加有關；在腦外傷、腦血管病基礎上，ET-1過量合成和釋放，又進一步加重了腦組織的損傷。因此，減少ET-1對于減輕腦組織損傷有著重要意義。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)也能調(diào)節(jié)ET-1水平[11]，缺氧與增齡能影響 ET-1及EPO的相互作用。在缺氧情況下EPO增多可減少ET-1的釋放。Sch?fer等[12]發(fā)現(xiàn)阻斷培養(yǎng)的老年大鼠神經(jīng)膠質(zhì)細胞ET-1 A受體后可增強EPO mRNA及EPO受體活性從而降低ET-1分泌。因此，老年人適當補充EPO有可能減少增齡所致ET-1增加。有研究證實，體育鍛煉能增加內(nèi)皮一氧化氮釋放從而減少ET-1生物活性，進而延遲老化過程[13-14]，老年女性增加鍛煉可減少循環(huán)血液的ET-1水平[15]，鍛煉也可預防隨年齡增加導致血壓生理性增高[13]。因此，老年人適當增加鍛煉，對于減少ET-1分泌、預防腦血管病有著重要意義。

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The expression of endothelin-1 in nerve cells in rat of different age

ZHANG Chunyan1，CONG Mei2，YANG Wen1，YU Xiaohong1，XU Hongtao1
(1.Department of Geriatric Gastroenterology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China；2.Wanshou Road Navy Sanatorium，Beijing 100853，China)

Objective To study the expression changes of endothelin-1(ET-1)on rat nerve cells so as to provide

for further understanding the etiology and pathogenesis of cerebrovascular disease.Methods Three different age groups of rats(1—2，6—7，＞24 months old) were studied and determined by streptaridin biotin peroxidase complex technique.Results The expression of ET-1 on striatus，cortex and hippocappus increased with age.Expression of ET-1 in these portions in＞24 months rats was significantly higer than that in the other 2 groups(P＜0.01).There was no significant difference on the expression of ET-1 in the different portions of the same group(P＞0.05).Conclusion The increased expression of ET-1 of neurons with aging may have important implications for the pathogenesis of cerebrovascular disease in the elderly.

Nerve eclls；Endothelin-1；Aging；Rat

R363

A

2095-3097(2015)04-0213-03

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.04.006

2015-02-15 本文編輯:徐海琴)

全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金(CHJ12L024)

100048北京，海軍總醫(yī)院干部消化科(張春燕，楊 文，于曉紅，徐洪濤)；100853北京，海軍萬壽路干休所(叢 梅)

徐洪濤，E-mail:xchun3＠sohu.com