郝夢(mèng)夢(mèng)，王國(guó)賀，郭藝紅

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心鄭州450052

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)卵胞漿內(nèi)單精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)能夠使生精功能輕度抑制的無(wú)精癥患者生育后代，但I(xiàn)CSI 技術(shù)存在的遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)不容忽視［1］。目前臨床上尚無(wú)有效治療睪丸內(nèi)無(wú)精子生成的方法，因此尋找生精障礙的分子生物學(xué)標(biāo)志，具有非常重要的意義。蛋白激酶C 相互作用蛋白1(protein interacting with C kinase 1，PICK1)是一個(gè)從線蟲(chóng)到人都高度保守的膜周蛋白，在多種組織中表達(dá)，其中在腦和睪丸中表達(dá)最高［2］。PICK1 蛋白參與體內(nèi)多種疾病的病理過(guò)程，如雄性不育癥、疼痛、腦卒中等，并參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)PICK1 參與小鼠精子頂體的形成，PICK1 基因敲除雄性小鼠出現(xiàn)不育。作者對(duì)無(wú)精癥者睪丸組織中PICK1 蛋白的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)分析，探討PICK1表達(dá)強(qiáng)度與精子發(fā)生、ICSI 妊娠結(jié)局及男性生育力的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1．1 研究對(duì)象 選擇2009年9月至2010年9月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心就診的無(wú)精癥患者50例，睪丸容積均≥12 mL;排除染色體核型異常，高泌乳素血癥，精索靜脈曲張，腮腺炎、結(jié)核、淋病等感染后遺癥等。無(wú)精癥診斷依據(jù)WHO 統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn):3次精液離心沉淀后鏡檢，均未發(fā)現(xiàn)精子。根據(jù)病理分類(lèi)及Johnson 評(píng)分法，生精功能基本正常(obstructive azoospermia，OA)15例(Johnson 評(píng)分8～10分)，生精功能低下(hypospermatogenesis，HS)9例(Johnson 評(píng)分6～7 分)，生精功能阻滯(spermatogenic arrest，MA)12例(Johnson 評(píng)分4～5 分)，唯支持細(xì)胞綜合征(sertolicellonly syndrome，SCOS)14例(Johnson 評(píng)分1～3 分)。

1．2 睪丸組織中PICK1 的檢測(cè) 研究對(duì)象行經(jīng)皮睪丸穿刺活檢術(shù)，標(biāo)本進(jìn)行HE 染色，顯微鏡下觀察睪丸組織曲細(xì)精管、界膜和間質(zhì)形態(tài)。選擇病理切片染色清晰、結(jié)構(gòu)完整的標(biāo)本，對(duì)其相應(yīng)的蠟塊行7 μm 厚切片，并固定于涂有APES 的專(zhuān)用載玻片上，采用免疫組化SP 法檢測(cè)PICK1 在睪丸組織中的表達(dá)，SP 試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)服務(wù)有限公司。陽(yáng)性染色表現(xiàn)為黃色或棕黃色顆粒狀著色。使用HPIA-2000 圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)陽(yáng)性染色的積分光密度(IOD)值。

1．3 治療 應(yīng)用ICSI 技術(shù)對(duì)OA組和HS組行助孕治療。采用常規(guī)黃體期長(zhǎng)方案超排卵、卵巢穿刺取卵、體外受精和胚胎移植［5］。移植術(shù)后第14 和18天檢測(cè)血β-HCG，確定是否生化妊娠;術(shù)后第35天檢查腹部彩超，宮內(nèi)可見(jiàn)孕囊、胎芽及原始心管搏動(dòng)者，確定為臨床妊娠。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0 分析，4組睪丸組織中PICK1 蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn);OA組和HS組年齡、不孕年限的比較應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，兩組正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率的比較采用χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 4組患者睪丸組織中PICK1 表達(dá)的比較 各級(jí)生精細(xì)胞中PICK1 多為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在胞漿或胞核中呈棕褐色著色;在間質(zhì)細(xì)胞及支持細(xì)胞中PICK1 呈弱陽(yáng)性表達(dá)或陰性表達(dá)(圖1)。OA、HS、MA 和SCOS組PICK1 蛋白表達(dá)水平分別為(147．67 ±7．48)、(127．79±4．94)、(106．73 ±8．70)和(1．91 ±1．01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 464．268，P＜0．001)，4組的表達(dá)水平依次降低(P＜0．05)。

圖1 睪丸組織中PICK1 免疫組化檢測(cè)結(jié)果(SP，×400)

2．2 OA 和HS組ICSI 結(jié)局的比較

2．2．1 一般情況 兩組男女雙方年齡、不孕年限比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

2．2．2 ICSI 結(jié)局 見(jiàn)表2。OA組正常受精率高于HS組;兩組卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和臨床妊娠率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組一般情況的比較

表2 兩組ICSI 結(jié)局的比較

3 討論

男性不育病因復(fù)雜，主要原因是精子發(fā)生障礙，而精子發(fā)生障礙主要由遺傳缺陷包括基因突變和染色體異常引起［6］。Xiao 等［4］報(bào)道小鼠敲除PICK1基因后表現(xiàn)為精子頂體形成畸形，生精小管凋亡增加，且精子活力嚴(yán)重下降。該研究發(fā)現(xiàn)，睪丸組織中PICK1 弱表達(dá)的患者，其精子的受精能力低于強(qiáng)表達(dá)者，提示PICK1 的表達(dá)程度可能與睪丸組織內(nèi)精子的受精能力相關(guān)。

有研究［7］對(duì)圓頭精子癥患者PICK1 基因突變進(jìn)行了篩查，發(fā)現(xiàn)PICK1 基因第13 外顯子出現(xiàn)G198A 純合錯(cuò)義突變，基因突變患者表型與PICK1(－ / －)小鼠表型一致。然而Yatsenko 等［8］對(duì)381名畸精癥患者GOPC (Golgi-associated PDZ and coiled-coilmotif-containing protein)、PICK1 和ZPBP1(zona pellucida binding protein 1)基因的cDNA 進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ZPBP1 基因突變與精子頭部畸形相關(guān)，而未發(fā)現(xiàn)GOPC、PICK1 基因突變。在不育男性中GOPC、PICK1 基因可能極少發(fā)生突變，或許它們與精子成熟的相關(guān)性更大。該研究結(jié)果顯示，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞高表達(dá)PICK1 蛋白，而間質(zhì)細(xì)胞及支持細(xì)胞低表達(dá)甚至不表達(dá)，且PICK1 表達(dá)強(qiáng)度與睪丸生精功能的強(qiáng)弱有關(guān)，推測(cè)PICK1 可能參與了精子形成的起始階段，并在精子成熟過(guò)程中起作用，PICK1 蛋白在睪丸組織中表達(dá)降低可能是男性生精功能障礙的原因之一。

PICK1 蛋白能與40 多種蛋白相互作用，它包含一個(gè)PDZ 結(jié)構(gòu)域和一個(gè)BAR 結(jié)構(gòu)域，PDZ 結(jié)構(gòu)域能和許多膜蛋白結(jié)合，極有可能成為藥物的靶點(diǎn)［9］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)使PICK1 在小鼠睪丸組織中特異性表達(dá)可以改善PICK1 敲除小鼠的精子生成異常和不育［10］。因此，PICK1 有可能成為男性不育的新的治療靶點(diǎn)，若能通過(guò)藥物促進(jìn)PICK1 在睪丸組織內(nèi)表達(dá)，可為男性不育患者的治療提供幫助。由于該研究樣本量較少，同時(shí)，男性生精功能受多因素影響，因此PICK1 與男性不育的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究、論證。

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