謝 毅，張 超

河南省人民醫(yī)院腹腔鏡治療研究中心鄭州450003

△男，1978年9月生，博士，主治醫(yī)師，研究方向:肝膽疾病，E-mail:174171368@qq．com

急性膽管炎在臨床上很常見，其治療的根本在于去除病因、解除梗阻、通暢引流。精氨酸(arginine，Arg)可調節(jié)細胞的免疫功能，有減輕炎癥反應的作用［1］。大柴胡湯中加入茵陳、金錢草等藥能清熱利濕退黃，保護肝臟功能［2］。TLR4 是介導內毒素脂多糖(LPS)反應的細胞表面特異性受體。LPS與TLR4 結合能激發(fā)下游傳導途徑，產(chǎn)生免疫應答，激發(fā)炎癥發(fā)生的過程［3］。該研究觀察了精氨酸聯(lián)用加味大柴胡湯對急性膽管炎大鼠肝組織TLR4 的影響，探討TLR4 在急性膽管炎中的作用，為臨床上治療急性膽管炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動物來源、藥物與試劑 動物來源:SD 大鼠90只，雌雄不拘，體重220～250 g，由廣東醫(yī)學院實驗動物中心提供。加味大柴胡湯方劑組成:柴胡、黃芩、白芍、半夏、綿茵陳、枳實、大黃、大棗、生姜、金錢草、木香。藥液制備:加味大柴胡湯生藥加水(m生藥∶m水=1∶4)浸泡，加熱煮沸，文火煎煮1 h，趁熱過濾;同法再煮2次，合并3次濾液，文火濃縮至含生藥量1 g/mL，－20℃冷藏備用，實驗中按照人和大鼠體表面積折算的劑量經(jīng)口灌藥［4］。Arg 購自杭州紐曲星生物科技有限公司。大鼠TLR4 引物及其GAPDH 內參引物(廣州達暉生物公司)，鱟試劑盒(廣東湛江安度司生物有限公司)。兔抗人TLR4 多克隆抗體及SP 試劑盒均購自福州邁新生物技術有限公司。

1．2 實驗分組與標本采取 90只大鼠按隨機數(shù)字表法分成5組:對照組、西藥組、中藥組、聯(lián)合組和假手術組，每組18只。前4組大鼠制備膽道急性感染模型［2］:在膽總管距離左右肝管匯合處1 cm 以遠剪開膽總管，遠端雙線結扎，近端插入麻醉導管，深度約6 mm。向管內注入0．5 mL 大腸桿菌O111B4 內毒素，生理鹽水稀釋至5 ×109CFU/mL，肝素帽封閉導管。對照組術后6 h 給予生理鹽水(2 mL/次，2次/d)灌胃，西藥組術后即給予Arg 300 mg/kg，中藥組術后6 h 給予加味大柴胡湯(2 mL/次，2次/d)灌胃，聯(lián)合組術后即給予Arg、術后6 h 給予加味大柴胡湯(方法用量同上)。各組分別于分組處理后24、48、72 h 取6只大鼠，用氯氨酮(100 mg/kg)靜脈麻醉后開腹，取門靜脈血標本和肝組織備用。

1．3 血清TB 水平檢測 取2 mL 門靜脈血，采用全自動血生化分析儀測定血清TB 水平。

1．4 血漿內毒素水平檢測 抽1 mL 門靜脈血，內毒素測定采用鱟試劑動態(tài)濁度法。

1．5 肝組織TLR4 mRNA 表達的檢測 采用RTPCR 法。取100 mg 肝組織，按照試劑盒(Qiagen 公司)說明提取總RNA，逆轉錄為cDNA。TLR4(264 bp)引物序列:上游5’-CACCCTCGAGTGGGAGGA CA-3’，下 游5’-CCTGTGAGGTCGTTGAGGTT-3’;GAPDH(272 bp)引物序列:上游5’-GGTGATGCT GCTGAGTA-3’，下 游:5 ’-ACTGTGGTCATGAGC CCTTC-3’。PCR 反應體系:總體積25 μL，模板cDNA 3．0 μL，QIAGEN ONE Step Buffer 5 μL，上、下游引物各1．5 μL、dNTP Mix 1 μL，QIAGN One Step RT-PCR Enzyme Mix 1 μL 和PCR 水12 μL。PCR 反應條件:94℃45 s;49．7℃1 min，72℃1 min 或50℃30 min(GAPDH)，95℃15 min，35個循環(huán);72℃10 min。PCR 產(chǎn)物用15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，用捷達801 凝膠成像分析系統(tǒng)觀察各擴增條帶的光密度值，計算TLR4 和GAPDH 擴增條帶平均光密度的比值，即TLR4 mRNA 的表達量。

1．6 肝組織TLR4 蛋白表達的檢測 采用免疫組化法。標本經(jīng)40 g/L 多聚甲醛溶液固定。免疫組化主要步驟:5 μm 厚的肝組織石蠟切片脫蠟，水化，抗原熱修復，PBS 沖洗5 min;滴加100 μL 過氧化氫，室溫孵育20 min，PBS 沖洗3次;滴加一抗(按1∶500 稀釋)，4℃冰箱過夜，PBS 沖洗3次，滴加山羊抗兔IgG 抗體，室溫孵育20 min，PBS 水沖洗3次。DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，50℃恒溫烤箱處理30 min，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色結果判斷:以細胞質和細胞膜呈棕黃色或棕黃褐色為陽性。陽性染色強度評分標準如下。0 分:陰性，與背景色完全一致;1 分:弱陽性染色，呈淡黃色或略深于背景色;2 分:陽性染色，呈中等黃色或深于背景色;3 分:強陽性染色，呈棕黃色或棕褐色。每張切片取10個高倍視野計數(shù)陽性細胞，計算陽性細胞率。0 分:陽性細胞率≤10%;1 分:陽性細胞率＞10%～;2 分:陽性細胞率26%～;3 分:陽性細胞率＞50%。兩項評分相加，＜1 分為無表達(－)，1～2分為低表達(+)，3～4 分為中度表達()，5～6 分為高表達()。

1．7 統(tǒng)計學處理 應用SAS 8．1 處理數(shù)據(jù)。采用單因素方差分析比較5組大鼠血清TB 水平、血漿內毒素水平及肝組織TLR4 mRNA 表達水平的差異，組間比較采用SNK-q 檢驗;采用行×列表的χ2檢驗比較5組大鼠肝組織TLR4 蛋白表達強度的差異。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 各組大鼠血清TB 水平的測定結果 見表1。與假手術組相比，其他4組不同時間點TB 升高;其他4組中，聯(lián)合組血清TB 水平最低。

2．2 各組大鼠血漿內毒素的變化 結果見表2。與假手術組相比，其他4組不同時間點血漿內毒素升高;其他4組中，聯(lián)合組血漿內毒素最低。

2．3 各組大鼠肝組織中TLR4 mRNA 的表達 結果見表3。與假手術組相比，其他4組不同時間點大鼠肝組織中TLR4 mRNA 的表達水平升高;其他4組中，聯(lián)合組TLR4 mRNA 的表達水平最低。

表1 各組大鼠不同時間點血清TB 的測定結果(n=6) U/L

表2 各組大鼠不同時間點血漿內毒素的變化(n=6) EU/mL

表3 各組大鼠不同時間點TLR4 mRNA 的表達比較(n=6)

2．4 各組大鼠肝組織中TLR4 蛋白的表達 結果見表4。

表4 各組大鼠不同時間點肝組織TLR4 蛋白的表達比較例

3 討論

急性膽管炎是指細菌感染所導致的膽道系統(tǒng)的急性炎癥。細胞因子和炎癥介質過度釋放、促炎介質/抗炎介質的失衡，炎癥信號傳導通路的激活在炎癥反應中起到重要的作用［5］。

急性膽管炎發(fā)病過程中，TLR4 作為炎癥信號傳導通路中的調控分子起著重要作用。血TLR4 介導內毒素引起的先天免疫系統(tǒng)激活和炎癥因子釋放［6］。相關研究［7］表明，炎癥因子釋放的程度與TLR4 表達量呈正相關，因而炎癥反應的劇烈程度可以通過TLR4 表達量的多少來反映。該研究結果顯示，在分組處理后的3個時間點，聯(lián)合組中TLR4 mRNA 和蛋白的表達較中藥組和西藥組減弱，提示中、西藥聯(lián)合作用下肝臟的炎性損傷與其他組比較明顯減輕。

加味大柴胡湯中的大黃成分能夠減輕內毒素引起的腸壁血管通透性升高，阻止腸腔中的細菌和毒素進入血液循環(huán)，從而抑制腸道細菌易位，減輕炎癥反應和炎性損傷［8］。有研究［8-9］表明，大黃可以清除體內氧自由基和降低血清中內毒素水平從而抑制炎癥反應。Arg 是一種T 細胞刺激因子，在急性膽管炎圍手術期補充Arg 能夠激活T 淋巴細胞，因而能清除活性氧自由基，減輕肝臟損傷和炎癥反應，預防炎癥引起的肝硬化，從而起到保護肝臟的作用［10］。內毒素的檢測作為血液細菌培養(yǎng)的輔助檢查能夠提示膽道感染。血清TB 是反映肝功能的指標。該實驗結果顯示處理后24、48 和72 h，雖然與假手術組相比，西藥組、中藥組和聯(lián)合組大鼠血漿內毒素水平和血清TB 水平升高，但聯(lián)合組血漿內毒素水平和血清TB 水平較西藥組和中藥組降低，提示中西藥聯(lián)合緩解肝臟炎癥損傷的療效好于單純中藥組或西藥組。

總之，加味大柴胡湯和Arg 可能是通過抑制炎癥因子、減輕炎癥反應，從而下調TLR4 的表達，切斷了部分炎癥信號傳導通路，減弱了由TLR4 介導的炎癥反應，因而減輕肝臟的損傷，為臨床上應用中西醫(yī)結合的方法治療膽管炎提供了依據(jù)。

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