李淑芳，龔玉梅，王宏俊，張培君

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 海淀 100195）

副雞禽桿菌的分離鑒定

李淑芳1，2，龔玉梅1，王宏俊1，張培君1

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 海淀 100195）

副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum）是雞傳染性鼻炎的病原菌。早在1920年，Beach首先報(bào)道雞傳染性鼻炎，1932年De Blieck就首次分離到該菌，并將其命名為雞嗜血紅蛋白鼻炎芽孢桿菌，在后來的很長一段時(shí)間內(nèi)都稱之為副雞嗜血桿菌。Blaclall于2005年又將其重新命名為副雞禽桿菌[1]。本病的發(fā)病特點(diǎn)是潛伏期短、傳播迅速，短時(shí)間內(nèi)便可波及全群。育成雞表現(xiàn)為生長不良或遲緩，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量明顯下降，處在產(chǎn)蛋高峰期的雞群產(chǎn)蛋會下降10%～40%[1]，甚至停產(chǎn)，混合感染時(shí)可引起死亡，給養(yǎng)殖戶造成較嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。

2014年6月，本實(shí)驗(yàn)室收到北京某公司雞場的7只31日齡病雞（其中2只死亡），具有典型雞傳染性鼻炎的臨床癥狀，未經(jīng)藥物治療。我們對病雞進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，具體報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病雞 來源于北京某公司雞場，具有典型的雞傳染性鼻炎的臨床癥狀，主要特點(diǎn)為面部單側(cè)或雙側(cè)腫脹、流鼻涕。

1.2 培養(yǎng)基 胰蛋白大豆瓊脂（Tryptic Soy Agar，TSA）、胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth，TSB）為BD公司產(chǎn)品，購自北京欣經(jīng)科生物試劑公司：TSA或TSB培養(yǎng)基在使用前均加入終濃度為50 μg/mL的NAD和10%的新生牛血清。

1.3 引物合成 參照陳小玲[2]的方法，將已知的Apg保守性片段引物序列，由生工北京分公司合成。上游引物：5′-TGAGGGTAGTCTTGCACGCGAAT-3′；下游引物：5′-CAAGGTATCGATCGTCTCTCTACT-3′。

1.4 A、B、C型副雞禽桿菌陽性血清，由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Pat Blackall教授惠贈。

1.5 菌株分離 無菌條件下處理送檢病例的雞頭，用燒紅的刀片燒烙眶下竇外表，無菌刀片切開眶下竇，然后用高壓后的棉拭子取眶下竇分泌物，接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃5%CO2溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，挑選單個(gè)可疑菌落繼續(xù)傳代進(jìn)行純化培養(yǎng)至長出均一的菌落。

1.6 染色鏡檢 挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌的染色和形態(tài)特征。

1.7 衛(wèi)星現(xiàn)象 接種環(huán)沾取液體培養(yǎng)物在血平板上密布劃橫線，再用產(chǎn)NAD的表皮葡萄球菌垂直劃一豎線，37℃5%CO2培養(yǎng)20 h，觀察細(xì)菌是否具有“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

1.8 回雞試驗(yàn) 挑取單菌落接種TSB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，取新鮮培養(yǎng)物0.2mL，每個(gè)分離株眶下竇接種2只40日齡SPF雞，接種后逐日觀察其臨床表現(xiàn)。

1.9 PCR鑒定 將上述新鮮TSB液體培養(yǎng)物取2 μL作模板，參照陳小玲等[2]的方法做PCR鑒定，同時(shí)將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，然后將測序結(jié)果同Gen?Bank中的相應(yīng)序列進(jìn)行比對。

1.10 分離株的血清學(xué)鑒定 （1）血清平板凝集試驗(yàn)：把分離株培養(yǎng)后制備抗原，在載玻片上加50 μL抗原，然后按照標(biāo)準(zhǔn)方法分別加50μL A、B、C陽性血清，同時(shí)設(shè)抗原對照、陰性、陽性血清對照，加樣后捏住玻片兩端輕柔地順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，使抗原與血清充分混合，3～5 min出現(xiàn)凝集者為陽性，反之為陰性；（2）HI試驗(yàn)鑒定血清型：參照Page程序鑒定分離株的血清型[3]。抗原的制備：37℃5%CO2在TSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，用2mL的TSB肉湯洗下，8 000 r/min離心5min，棄上清后再用2 mL PBS重懸，洗3遍后，沉淀用1mL PBS重懸，在4℃放置3～7 d，即為Page程序所需抗原。用此抗原按照Blackall的方法進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)[3]（HI試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清分別作200、400、800倍稀釋）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及初步鑒定 從7只可疑病雞的眶下竇內(nèi)共獲得6個(gè)分離株，經(jīng)過傳代純化培養(yǎng)，在含有NAD和牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上，觀察到半透明露滴樣的針尖樣小菌落，且在普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長。過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭染色，鏡下可觀察到均為革蘭陰性短桿菌。

2.2 衛(wèi)星現(xiàn)象 在血平板上6個(gè)分離株均呈現(xiàn)典型的衛(wèi)星現(xiàn)象：在葡萄球菌附近生長的菌落較大且旺盛，離的越遠(yuǎn)菌落越稀疏且越小。

2.3 PCR結(jié)果 6個(gè)分離株和標(biāo)準(zhǔn)株均在500 bp位置處出現(xiàn)了DNA條帶，同時(shí)陰性對照成立（圖1），PCR產(chǎn)物測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對與Apg同源性高達(dá)98%。

圖1 PCR結(jié)果M：Marker（DL 2 000）；1～6：分離株的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 回雞試驗(yàn) 用分離菌株人工感染的12只SPF雞在24 h后都出現(xiàn)精神委靡、眶下竇及面部腫脹、流鼻涕等典型的雞傳染性鼻炎的癥狀，且在感染雞的眶下竇又重新分離到純的副雞禽桿菌菌落。

2.5 血清型鑒定 Page程序?qū)λ蟹蛛x株的血清型鑒定結(jié)果一致，見表1。結(jié)果判定該分離株為B型。分離株與A型C型200～800倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清均為HI陰性，而與B型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清800倍稀釋后仍出現(xiàn)陽性[4]。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)中的所有分離株革蘭染色為陰性短桿菌；將分離株人工感染SPF雞24 h后均出現(xiàn)面部嚴(yán)重腫脹、精神委靡、食欲減退、鼻腔有黏液流出等典型的雞傳染性鼻炎的臨床癥狀，同時(shí)在發(fā)病雞的眶下竇又重新分離到該菌；PCR鑒定結(jié)果為陽性且測序比對結(jié)果證實(shí)和副雞禽桿菌的同源性極高；在含有NAD和牛血清的TSA固體培養(yǎng)基上呈針尖大小的露滴狀生長，而在普通培養(yǎng)基中不生長；因?yàn)楦彪u禽桿菌的生長依賴V因子，本試驗(yàn)中把分離株與葡萄球菌交叉接種于血平板上，利用葡萄球菌產(chǎn)生的V因子促進(jìn)副雞禽桿菌生長，此種現(xiàn)象被稱為“衛(wèi)星現(xiàn)象”，該特征可視為該菌鑒定的重要依據(jù)[1]。本試驗(yàn)中的鑒定結(jié)果可以判定分離株均為副雞禽桿菌。當(dāng)下實(shí)驗(yàn)室最通用的Apg血清學(xué)分型方法仍是Page方案[5]，參考傳統(tǒng)的方法通過血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)鑒定其血清型，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有的分離株均為我國普遍流行的B型。

表1 Page方法的HI分型結(jié)果

目前，關(guān)于副雞禽桿菌分離株的報(bào)道大都集中在育成雞群和產(chǎn)蛋雞群中[6-7]，本試驗(yàn)中的6個(gè)分離株都是從31日齡的雛雞中分離得到的，且發(fā)病日齡在24日齡。針對4周齡內(nèi)雛雞暴發(fā)雞傳染性鼻炎在我國還是第1次，說明我國雞傳染性鼻炎的流行可能已經(jīng)出現(xiàn)新的特點(diǎn)，在疾病預(yù)防和控制中應(yīng)加以注意。

[1]Saif Y M.蘇敬良，高福，索勛，譯.禽病學(xué)[M].12版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：930-940.

[2]Chen X，Mifilin J k，Zhang P，et al.Development and app lication of DNA probes and PCR tests for Haemophilus Paragallinarum[J]. Avian Dis，1996，40：398-407.

[3]Blackall P J，Eves L E，AUSG.Serotrping of Haemophilus para?gallinarum by the page scheme：com-Parison ofthe use of aggluti?nation and hemagglutination inhibition tests[J].Avian Dis，1990，34：643-645.

[4]苗立中，沈志強(qiáng)，王艷，等.蛋雞傳染性鼻炎病原的分離鑒定[J].中國家禽，2007，29（9）：19-21.

[5]Page L A.Haemophilus infection in chickens I.Characteristics of 12 Haemophilus isolates recovered from diseased chickens[J].Am JVetRes，1962，23：85-95.

[6]張培君，苗得園，龔玉梅，等.B型副雞嗜血桿菌的分離鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，25（1）：56-58.

[7]路迎迎，路明華，陳小玲，等.B型副雞禽桿菌安徽株的分離與鑒定[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（1）：122-125.

S858.31

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0529-6005（2015）11-0058-02

2015-01-29

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)-家禽主要細(xì)菌病防控技術(shù)研究與示范（201303044）

李淑芳（1987-），女，碩士，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：lishufang0915@163.com

龔玉梅，E-mail：gongyumei1961@163.com