何定峰， 洪佳妮， 徐先祥， 秦 思

（1.福建省泉州市中醫(yī)院，福建泉州362000；2.華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院，福建泉州362021）

七葉蓮總?cè)频奶崛」に嚰捌浜繙y定

何定峰1， 洪佳妮1， 徐先祥2*， 秦 思2

（1.福建省泉州市中醫(yī)院，福建泉州362000；2.華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)院，福建泉州362021）

目的 考察比色法測定七葉蓮中總?cè)坪辛康娘@色條件，并對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法 以齊墩果酸為對照品，對顯色條件進(jìn)行考察，包括5%香草醛-冰醋酸用量、高氯酸用量、水浴溫度、反應(yīng)時(shí)間，建立測定條件。再以總?cè)坪辛繛橹笜?biāo)，采用正交試驗(yàn)法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果 5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL為宜，高氯酸用量以1.2 mL為宜，水浴溫度以70℃為宜，反應(yīng)時(shí)間以20 min為宜，并于顯色后30 min內(nèi)進(jìn)行測定。優(yōu)選的提取工藝為以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，回流提取60 min，此工藝下總?cè)频钠骄|(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.58%。結(jié)論在優(yōu)選的顯色條件下，該方法操作簡便快速、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，并且工藝穩(wěn)定可行，可應(yīng)用于七葉蓮總?cè)瞥煞值奶崛　?/p>

七葉蓮；總?cè)?；顯色條件；提取工藝；比色法；正交試驗(yàn)

七葉蓮又名七葉藤、漢桃葉，為五加科植物七葉蓮Schefflera arboricola Hayata的干燥莖葉，主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣等地，以根、莖、葉入藥［1］。其味苦、甘，性溫，有散瘀止痛，活血消腫之功效，臨床上主要用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛、胃及十二指腸潰瘍疼痛等癥狀［2］。近年來，七葉蓮在化學(xué)成分、藥理作用方面有大量研究［3-6］，發(fā)現(xiàn)該植物除含有機(jī)酸、揮發(fā)油、蛻皮激素等成分外，主要為齊墩果烷型三萜及其苷類［2，7］。藥理研究表明，三萜類化合物具有廣泛的生理活性，如消炎抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、增加免疫力、保肝解毒等［8-9］。目前關(guān)于七葉蓮三萜類成分的研究很少，本實(shí)驗(yàn)利用比色法測定七葉蓮總?cè)频暮辛?，考察最適宜的顯色條件，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為該植物的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

Sartorius BSA124S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；DJ-04型中藥粉碎機(jī) （上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）；HH-1型電熱恒溫水浴鍋 （江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；KQ 500E型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；RE 52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì) （日本島津公司）。

七葉蓮藥材 （福建省泉州中僑集團(tuán)股份有限公司藥業(yè)公司），經(jīng)本院湯少陵主管中藥師鑒定為七葉蓮S.arboricola Hayata的干燥莖葉。齊墩果酸對照品 （含有量測定用，批號201206，中國食品藥品檢定研究院）。香草醛、冰醋酸、高氯酸、95%乙醇、甲醇等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試溶液的制備 取干燥至恒重的七葉蓮藥材，粉碎過篩，稱定20.00 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入15倍量75%乙醇，水浴加熱，回流提取60 min，提取液過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，干燥。再精密稱定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，即得。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品10.00 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，精密吸取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

2.3 顯色工藝的考察

2.3.1 顯色波長的確定 參照文獻(xiàn) ［10］，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法進(jìn)行顯色。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試溶液0.5 m L，置于具塞試管中，水浴揮干，依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL混勻，密塞，60℃水浴中加熱20 min，取出，冰水浴冷卻10 min，加冰醋酸5 mL，搖勻。然后，不加供試溶液而加顯色劑溶液，同法制得空白對照液，紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)掃描結(jié)果，取最大吸收峰處波長541 nm作為檢測波長，見圖1。

2.3.2 5%香草醛-冰醋酸用量考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后再分別加入高氯酸0.8 m L，置于60℃水浴中加熱15 min后取出，冰水浴冷卻10 m in，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，置于室溫下15 min后測定其吸光度，結(jié)果見圖2。根據(jù)結(jié)果，選定5%香草醛-冰醋酸溶液的最佳用量為0.3 mL。

圖1 香草醛-冰醋酸-高氯酸法顯色后的吸收光譜圖

圖2 5%香草醛-冰醋酸用量對顯色體系的影響

2.3.3 高氯酸用量考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 6份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL，再加入高氯酸0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，60℃水浴中加熱15 min后取出，冰水浴冷卻10 min，加入冰醋酸5.0 mL，搖勻，置于室溫下15 min后測定其吸光度，結(jié)果見圖3。根據(jù)結(jié)果，選定高氯酸的最佳用量為1.2 mL。

圖3 高氯酸用量對顯色體系的影響

2.3.4 水浴溫度的考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 5份，水浴蒸干后加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸溶液1.2 mL，分別于40、50、60、70、80℃水浴加熱15 min。同時(shí)，做空白對照，測定不同水浴溫度下的吸光度值，并觀察各溫度下空白顏色是否發(fā)生變化，結(jié)果見圖4。由圖可知，吸光度隨溫度的升高而增加，但超過70℃時(shí)，空白液顏色開始發(fā)生變化，故確定最佳水浴溫度為70℃。

2.3.5 反應(yīng)時(shí)間的考察 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 5份，分別水浴10、15、20、25、30 min，然后測定其吸光度，結(jié)果見圖5。由圖可知，水浴加熱10～20 m in時(shí)，吸光度值急劇增加，20 min后緩慢遞增，但時(shí)間過長會導(dǎo)致空白液顏色發(fā)生變化，故選定最佳反應(yīng)時(shí)間為20 min。

圖4 水浴溫度對顯色體系的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對顯色體系的影響

2.4 方法學(xué)考察與總?cè)茰y定

2.4.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.10、0.30、0.50、0.70、0.90 mL，置于具塞試管中，水浴蒸干，再依次加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.3 mL、高氯酸1.2 mL混勻，密塞，70℃水浴中加熱20 min，取出冷卻至室溫后，加冰醋酸5 mL定容至刻度，搖勻。再以顯色劑為空白，于541 nm處測定吸光度值 （A）。以A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo) （C）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=41.795C-0.013 1（r=0.999 1），線性范圍為1.54～13.85 mg/L，表明線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液6份，每份0.5 mL，進(jìn)樣分析，得RSD為0.60%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批樣品6份，按 “2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得RSD為1.55%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試溶液0.5 mL，分別于顯色后0、15、30、45、60、90 min測定吸光度，得30 min內(nèi)的RSD為1.26%，而30 min后穩(wěn)定性開始下降。因此，該溶液在30 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，即應(yīng)在顯色后30 min內(nèi)進(jìn)行測定。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn) 精確稱取含有量已知的供試溶液6份，每份0.3 mL，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，進(jìn)樣分析，計(jì)算平均加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.5 總?cè)铺崛》椒ǖ目疾?/p>

2.5.1 提取步驟 精密稱取七葉蓮粉末9份，每份20.00 g，分別置于圓底燒瓶中，加入相應(yīng)濃度和體積的乙醇，水浴加熱，按相應(yīng)時(shí)間進(jìn)行回流提取，提取液過濾，濾液減壓濃縮回收乙醇，干燥。再精密稱定提取物20 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，稀釋至刻度，即得供試溶液。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5.2 因素水平和方差分析 根據(jù)前期單因素試驗(yàn)考察情況，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間這3個(gè)影響提取物總?cè)坪辛康闹饕蛩?，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平 （表2），進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)，見表3，方差分析結(jié)果表4。由表3可知，各因素影響順序依次為A＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取結(jié)果的影響最大，其次為提取時(shí)間、料液比。由表4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)有顯著影響 （P＜0.05）。因此，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)考慮，最佳提取工藝參數(shù)組合為A3B1C2，即以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，回流提取60 min。

表2 因素水平

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選的工藝提取3次，得到總?cè)频馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為23.02%、22.32%、22.40%，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22.58%，RSD為1.69%，表明該優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

中藥總?cè)祁惓煞值牡臏y定一般采用分光光度法［11］，常用的顯色體系有香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-冰醋酸-硫酸和香草醛-乙醇-硫酸［12-14］。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，選用香草醛-冰醋酸-高氯酸作為比色法測定七葉蓮總?cè)屏康娘@色劑，但顯色劑的用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間、反應(yīng)后放置時(shí)間等因素對結(jié)果的影響較大，因此對顯色條件進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%香草醛-冰醋酸溶液用量以0.3 mL為宜，高氯酸用量以1.2 mL為宜，水浴溫度以70℃為宜，反應(yīng)時(shí)間以20 m in為宜，并于顯色后30 min內(nèi)在541 nm波長下進(jìn)行測定。該方法操作簡便快速、靈敏度高、測定結(jié)果穩(wěn)定、重現(xiàn)性好但，測定時(shí)應(yīng)注意控制反應(yīng)溫度和時(shí)間。

以提取物總?cè)频寐蕿橹笜?biāo)，經(jīng)正交試驗(yàn)優(yōu)化的七葉蓮總?cè)谱罴烟崛」に噮?shù)為以95%乙醇為溶劑，料液比1∶10，水浴回流提取60 min。經(jīng)驗(yàn)證，該提取工藝穩(wěn)定可行，可作為七葉蓮總?cè)瞥煞值奶崛」に嚒?/p>

七葉蓮總?cè)坪辛康臏y定方法及提取工藝尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)考察比色法測定的顯色條件，并以正交試驗(yàn)對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，這為該植物有效成分的進(jìn)一步開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

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R284.2

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1001-1528（2015）12-2761-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.042

2014-07-29

福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 （2012Y0049）；泉州市衛(wèi)生局科研資助項(xiàng)目

何定峰（1965—），男，副主任藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院藥學(xué)。E-mail：Dingfenghe@hotmail.com

*通信作者：徐先祥，男，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：xuxianxiang@163.com