范世明，陳 琳，林 婧，于虹敏，黃學(xué)城，許 文，3，陳 丹，黃澤豪

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州350122）

三葉青是我國(guó)特有的珍稀藥用植物，又名三葉崖爬藤（Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg），為葡萄科崖爬藤屬植物，主要分布于我國(guó)南方的浙江、江西、福建、廣東、廣西、云南、海南、臺(tái)灣等省區(qū)，其塊根在民間被廣泛藥用。據(jù)《全國(guó)中草藥匯編》中記載：“三葉青，味苦性平。具有清熱解毒，祛風(fēng)化痰，活血止痛的功效。”［1］據(jù)報(bào)道［2］三葉青中的化學(xué)成分有黃酮、還原糖、甾類化合物、氨基酸等，其中黃酮是重要的生理活性物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明三葉青總黃酮部位具有抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用［3－5］。文獻(xiàn)［6］表明，三葉青的葉（或全株）在民間也供藥用，如《海南植物志》中記載三葉青全株可用于白喉、風(fēng)濕性腰痛等?！吨袊?guó)植物志》［7］中也記載全株供藥用?！杜_(tái)灣藥用植物圖鑒》中記載其鮮葉搗碎可以治皮膚?。?］。目前不同產(chǎn)地的三葉青塊根總黃酮含量測(cè)定方法已有報(bào)道［9－10］，但未見三葉青葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)報(bào)道，三葉青地上部分化學(xué)成分定性鑒別的結(jié)果表明，黃酮是其主要成分之一［11］。因福建的順昌、泰寧、福安等地已開始大量種植三葉青，有必要建立測(cè)定三葉青葉中總黃酮含量的方法，為三葉青葉的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV 9100紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；SartoriusCPA225 D十萬(wàn)分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；KQ－500 E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；

1.2 試藥 三葉青葉2013年8月～12月實(shí)地采自福建順昌、泰寧、福安等地，采下葉片（帶葉柄），晾干；部分購(gòu)自浙江臺(tái)州、麗水等地，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室盧偉教授鑒定為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤Tetrastigmahemsleyanum Dielset Gilg.的干燥葉。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110774－201113）；甲醇（德國(guó) Merck公司，色譜純）；水為超純水（美國(guó)m illipore公司）；其它試劑為分析級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品，用甲醇制成每1m L含蘆丁0.402m g的對(duì)照品溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備 取三葉青葉供試品，粉碎過(guò)40目篩，取粉末1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇50m L，精密稱定，超聲（250 W，40k H z）處理30min，放冷，精密稱定后用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 總黃酮的顯色方法及測(cè)定波長(zhǎng) 參考文獻(xiàn)［9］測(cè)定方法，精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各4m L分別置25m L量瓶中，分別加甲醇至10m L，按下述顯色方法顯色：加入15%新鮮配制的亞硝酸鈉溶液1 m L，10%硝酸鋁溶液1m L，搖勻后放置6min，加入10%新鮮配制氫氧化鈉溶液10m L，用甲醇定容，搖勻后放置15min，即得對(duì)照品顯色溶液及供試品顯色溶液。上述2種顯色溶液分別以同樣處理的空白顯色體系為參比，在410～800n m波長(zhǎng)處掃描，對(duì)照品與樣品紫外吸收基本一致，最大吸收波長(zhǎng)在500 n m，故選擇500n m為比色測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8、9m L到25m L量瓶中，加甲醇至10m L，制備得不同梯度濃度的對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)顯色，各對(duì)照品顯色體系，以同樣處理的空白顯色體系為參比，在500n m波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度A對(duì)濃度C進(jìn)行回歸計(jì)算，得線性回歸方程：

A ＝0.0057 C＋0.0410 r＝0.9994

線性范圍為16.08～144.72μg／m L。

2.4.2 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各4m L，分別置于25m L量瓶中，按2.3項(xiàng)分別顯色，在紫外分光光度計(jì)上連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果對(duì)照品和供試品顯色產(chǎn)物吸光度的RSD為0.21%、0.27%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同批三葉青的葉樣品1g，6份，按2.2項(xiàng)制成供試品溶液，精密吸取4 m L，按2.3項(xiàng)顯色，測(cè)定吸光度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得該批次三葉青中總黃酮平均含量2.69%，RSD 2.09%。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液和供試品溶液各4m L，分別置于25m L量瓶中，按2.3項(xiàng)顯色處理后，在120min內(nèi)每隔15min測(cè)定吸光度。結(jié)果表明，對(duì)照品和樣品顯色產(chǎn)物在室溫下120min內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)同批次三葉青的葉樣品0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加入近似樣品總黃酮含有量的對(duì)照品量（蘆丁13.5 m g），按2.2項(xiàng)制成供試品溶液，精密吸取4m L，按2.3項(xiàng)顯色，測(cè)定吸光度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，平行測(cè)定6份，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)

2.5 樣品含量測(cè)定 精密稱取不同產(chǎn)地三葉青的葉樣品各1g，每批測(cè)定3份，按2.2項(xiàng)制成供試品溶液，精密吸取4m L，按2.3項(xiàng)顯色，以相應(yīng)的空白顯色體系試劑為參比，測(cè)定吸光度。同時(shí)測(cè)定各個(gè)批次三葉青葉含水量，按干燥品，計(jì)算得不同產(chǎn)地三葉青葉中總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表2 福建不同產(chǎn)地三葉青葉總黃酮的含量測(cè)定

3 討 論

3.1 采用紫外可見分光光度法測(cè)定閩產(chǎn)三葉青的葉中總黃酮含量，該方法經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察符合分析要求，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適合于三葉青葉的定量分析和品質(zhì)評(píng)價(jià)，為三葉青葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 福建不同產(chǎn)地三葉青葉總黃酮含量測(cè)定比較表明不同產(chǎn)地其總黃酮含量差異較大，其中以永泰、大田、閩侯、仙游、漳平的含量較高，達(dá)到3%以上，相對(duì)高于浙江三葉青主產(chǎn)地，提示閩產(chǎn)三葉青中這些產(chǎn)地品質(zhì)較好，適合開發(fā)利用。

［1］《全國(guó)中草藥匯編》編寫組 .全國(guó)中草藥匯編：上冊(cè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1975：31－32.

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［3］丁麗，紀(jì)其雄 .三葉青抗腫瘤活性部位的篩選研究［J］.海峽藥學(xué)，2011，23（12）：46－48.

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