張婷婷 ，王 蘋，張建偉 ，吳惠燕

（福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州350122）

乳腺增生病的發(fā)生、發(fā)展是乳腺上皮細胞增殖過度和凋亡減弱共同作用的結果。研究［1］證實絲裂原激活蛋白激酶／細胞外信號調節(jié)激酶（MAPK／ERK）信號轉導通路的異?；罨軌驅е录毎麊适У蛲龊头只哪芰?，促使細胞異常增殖。通過調控信號傳導途徑治療腫瘤、防止癌變，已成為人們日益關注的焦點。我們通過實驗觀察當歸芍藥散加味方對乳腺增生模型大鼠乳腺組織中ERK蛋白表達的抑制作用和乳腺組織形態(tài)變化，探討其可能的機制。

1 材 料

1.1 動物及分組50只SPF級SD雌性健康未孕大鼠，體質量（198.58±6.78）g，上海市西普爾必凱實驗動物有限公司提供，福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購，許可證號：SCXK（滬）2008－0016，合格證號：2008001601331。適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組10只，實驗組40只。造模30d后，實驗組再隨機分為模型組、當歸芍藥散加味方組、乳癖消組，每組10只。實驗場所在福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號：SYXK（閩）2009－0001。

1.2 藥物和試劑 ① 當歸芍藥散加味方（自擬）：當歸15g，白芍15g，川芎8g，茯苓10g，白術15g，澤瀉10g，浙貝母12g，柴胡8g，香附12g，丹參15g。將生藥經(jīng)蒸餾水浸泡1h，文火煎煮2次，每次60min，取汁合并，4層紗布過濾2次，70℃～80℃水浴濃縮至240%濃度的藥液（含生藥2.4g／mL），冰箱儲存?zhèn)溆谩＂诒郊姿岽贫甲⑸湟海?mL：2mg）。③黃體酮注射液（20mg／mL）。④乳癖消片（0.32g／?！?0粒）。⑤10%水合氯醛溶液。⑥S－P試劑盒，ERK抗大鼠，蘇木素染色，中性樹膠，多聚賴氨酸。

2 方 法

2.1 造模方法 除正常對照組外，其余3組用雌、孕激素序貫法造模，按體質量0.5m g／（k g／d）于大鼠后肢后外側肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，連續(xù)25d；繼而用黃體酮注射5m g／（k g／d），每日1次，連續(xù)5d。正常對照組肌肉注射生理鹽水0.1m L／只，每日1次，連續(xù)30d。

2.2 給藥方法 模型組與正常對照組大鼠按1 m L／（k g／d）生理鹽水灌胃；治療組用當歸芍藥散加味方制成湯劑，按24g／k g的生藥提取液灌胃30d；乳癖消組按成人劑量9粒（2.88g／d）的6.25倍，即0.3g／k g乳癖消片以生理鹽水研磨配成混懸液灌胃30d。

2.3 標本采集 4組大鼠灌胃30d后，禁食24h，處死大鼠并經(jīng)乳頭向基底部最大面積取下第二、三對乳房，標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，待做組織學觀察和免疫組化檢測。

2.4 檢測方法

2.4.1 病理學觀察 常規(guī)取材、固定、脫水、石蠟包埋切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察乳腺組織切片的組織學變化。

2.4.2 ERK檢測 用S－P法檢測乳腺上皮組織ERK蛋白表達。乳腺組織一部分切片脫蠟水化，20 g／m L蛋白酶K消化20min，3%H2O2阻斷，加入ERK一抗過夜，按S－P試劑盒要求步驟進行操作，DAB顯色，蘇木素復染，干燥封片。

2.5 結果判定

2.5.1 病理學觀察 光學顯微鏡下觀察4組大鼠乳腺小葉、腺泡、導管、纖維組織增生情況。

2.5.2 ERK表達 在光學顯微鏡下ERK蛋白陽性表達為細胞核和（或）細胞漿著棕黃色，任選取5個最佳視野進行拍照，將照片在同一條件下用美國MediaCybernetics公司專業(yè)圖片分析軟件Image－ProPlus6.0進行免疫組化光密度測定，取上述5個視野的均值為該檢測樣本的ERK平均光密度值。

3 結 果

3.1 4組ERK表達比較 見表1。

表1 4組ERK表達比較（±s）

表1 4組ERK表達比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與乳癖消組比較，3）P＜0.05。

組 別 大鼠／只 ERK／%1013.39±1.74模 型 組 1041.98±3.481）乳癖消組 1028.86±2.061）2）當歸芍藥散加味方組 1022.48±3.101）2）3）正常對照組

3.2 乳腺組織變化 空白對照組：乳腺小葉比較少見，乳腺小導管及腺泡上皮細胞未見增生；乳腺間質未見纖維組織增生；皮膚附件基本正常，見圖1。模型組：乳腺組織出現(xiàn)明顯的增生，乳腺小葉體積增大，分葉增多，腺泡數(shù)目增多，管腔中可見脫落的上皮細胞及其分泌物，纖維組織增生。證明乳腺增生造模成功，見圖2。乳癖消組：乳腺組織增生程度較輕，乳腺導管上皮排列基本規(guī)則，腺泡腔和腺導管腔無擴張，腔內分泌物較少，小葉體積縮小，小葉中腺泡數(shù)減少，纖維結締組織增生減輕，見圖3。當歸芍藥散加味方組：乳腺組織輕度增生，乳腺導管上皮排列基本規(guī)則，未見明顯的腺泡腔和腺導管腔擴張，腔內分泌物減少，小葉體積縮小，小葉中腺泡數(shù)也明顯減少，纖維結締組織增生明顯減輕；皮膚組織附件基本正常，見圖4。

4 討 論

4.1 ERK表達的意義 實驗結果顯示，乳腺增生大鼠模型中存在著ERK的陽性表達，給藥30d后當歸芍藥散加味方組和乳癖消片組ERK的陽性表達率減弱，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05），當歸芍藥散加味方組優(yōu)于乳癖消片組。提示乳腺增生存在著ERK的陽性表達，當歸芍藥散加味方能抑制模型大鼠乳腺組織ERK陽性表達。

4.2 當歸芍藥散加味方的組方與作用機理分析

當歸芍藥散出自張仲景的《金匱要略》，治療肝脾失調、血郁濕滯的腹痛。方由當歸、白芍、川芎、茯苓、澤瀉、白術組成。方中重用白芍配當歸、川芎以調肝；茯苓、澤瀉、白術健脾除濕以治脾。全方使肝血足則氣條達，脾運健則濕邪除。本實驗在原方基礎上加了浙貝母、柴胡、香附、丹參4藥，浙貝母苦寒，開泄力大，化痰散結作用較強，常用于瘀結阻滯之病。一味丹參功同四物，具有活血調經(jīng)、祛瘀止痛消癰作用。柴胡疏肝解郁、理氣止痛，柴胡與香附相配增強疏肝解郁之功，緩解乳房疼痛的癥狀，使氣機調暢，肝郁得舒；化痰除濕，使脾氣健運，生化有權，從而達到調整全身臟腑的功能；佐以活血化瘀、散結止痛之品，使得痰濕瘀之邪去除，緩解乳房局部癥狀，標本兼顧。從實驗結果看，乳腺增生模型大鼠中存在ERK的陽性表達，當歸芍藥散加味方可以降低模型大鼠乳腺組織ERK蛋白表達。文獻［2］認為處于活化狀態(tài)的MAPK通路，誘導細胞增殖、血管新生相關因子的活化，從而打開細胞增殖、血管新生的開關，導致細胞異常增生，此機理可能是導致乳腺增生病發(fā)生的原因。ERK作為MAPK／ERK信號轉導通路中的重要蛋白，一定程度上反映了此通路的活化程度。當歸芍藥散加味方能夠改善乳腺組織的增生狀態(tài)，其作用機理可能是通過調理肝脾，化瘀散結，抑制活化的MAPK途徑中ERK的高表達，從而關閉細胞增殖及血管新生的開關，抑制乳腺上皮細胞增殖。

［1］高艷艷，吳素慧 .P D 98059對人子宮頸癌細胞株S i h a增殖和凋亡的影響［J］.中國醫(yī)療前沿，2011，6（2）：38－39.

［2］王娜，宋卓敏，阮氏水 .益氣消癥法對雌激素誘導子宮肌瘤模型豚鼠子宮組織ME K 2、p－ERK蛋白表達的影響［J］.中國中西醫(yī)結合雜志，2013，33（10）：1408－1411.