范海青

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州350003）

電針刺激背部腎俞、會陽能有效治療前列腺增生（benignprostatichyperplasia，BPH），鑒于前列腺增生與細胞凋亡的密切關(guān)系，在探求電針對BPH的機制研究中，我們選取與BPH的發(fā)生密切相關(guān)的線粒體凋亡通路進行研究，對凋亡相關(guān)因子Bcl－2、Bax表達進行檢測，探討電針治療B P H的作用靶點，從分子水平闡明電針治療前列腺增生的機理。

1 材料與方法

1.1 動物選擇 3月齡雄性S D大鼠25只，體質(zhì)量（250±20）g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

1.2 動物分組 將S D大鼠飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境后，隨機取5只作為手術(shù)但不去勢組（假手術(shù)組），其余20只采用去勢后注射丙酸睪酮造模，即在無菌操作下，手術(shù)切除雙側(cè)睪丸，待大鼠蘇醒后將其隨機分為4組：模型組、針刺腎俞、會陽穴組（針刺組）、保列治組（西藥組）、電針腎俞、會陽穴組 （電針組），每組5只。去勢第8天起，每只大鼠皮下注射丙酸睪酮酮1m g／（300g／d），同時給予相應(yīng)的處理，連續(xù)4周。

1.3 大鼠飼養(yǎng) 飼養(yǎng)期間觀察大鼠毛色、食欲、活動、體質(zhì)量變化。

1.4 實驗治療 ① 分組治療：術(shù)后第8天起，假手術(shù)組每天抓取1次，并皮下注射注射用水0.l m L／只，固定30min。模型組每天抓取1次，皮下注射丙酸睪酮后，固定30min。針刺組皮下注射丙酸睪酮后，針刺1次，留針30min。電針組皮下注射丙酸睪酮后，電針腎俞、會陽穴1次，留針30min。西藥組注射丙酸睪酮后，保列治1.67 m g／k g，臨用前用蒸餾水配制成0.167 m g／m L的混懸液，灌胃，連續(xù)4周。實驗期間，每7天稱體質(zhì)量1次，以調(diào)整給藥量。②針刺方法：針刺組、電針組取雙側(cè)腎俞穴、會陽穴，用75%酒精消毒，用30號0.5寸毫針，腎俞斜刺向脊柱方向6mm，會陽稍向內(nèi)前斜刺6mm。電針組接電針，同側(cè)相連，正極在上，負極在下，疏密波刺激，H1為2H z，H2為100H z，電壓為2V，強度以見鼠尾稍擺動而無明顯掙扎為宜，留針30min。每日1次，5d為1個療程。療程后休息2d，共進行4個療程。③ 取材：在末次給藥、針刺24h后，所有大鼠稱體質(zhì)量，然后以3%戊巴比妥鈉1 m L／k g腹腔注射麻醉，剖開腹部，迅速摘取前列腺于冰袋上。

1.5 檢 測

1.5.1 主要試劑①Trizol試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；②β－actin、Bc1－2、Bax引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成）；③RT－PCR試劑盒（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.5.2 主要儀器①PCR基因擴增儀（美國PE生物系統(tǒng)公司）；②化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio－rad公司）；③64R型低溫高速離心機（美國Beckman公司）。

1.5.3 β－actin、Bc1－2、Bax引物β－actinmRNA：sense：5－TTGGCACCACACTTTCTACA－3’；antisense：5’－TCACGCACGATTTCCCTCTCA－3’；擴增片段長度442bp。Bc1－2mRNA：sense：5’－CCATGTGTCCATCTGACC－3’；antisense：5’－GCCATATAGTTCCACAAA－3’；擴增片段長度330bp。BaxmRNA：sense：5，－CTAGCAAACTGGTGCTCAAGG－3’：antisense：5’－CGAAGTAGGAGAGGAGGCCT－3’；擴增片段長度147bp。

1.5.4RT－PCR檢測各組基因Bcl－2、BaxmRNA表達總RNA的提取：取10mg低溫保存的前列腺組織塊加lmL酚、異硫氰酸胍的均相溶（Trizo1），機械勻漿，吹打混勻；將勻漿液轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌管中，室溫靜置15min；加0.2mL氯仿，輕搖震蕩15s，室溫靜置2min；4℃、12000r／min離心15min，取上清液；將上清水相（約1mL）移入新的EP管，加異丙醇0.5mL，混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，棄上清；加入75%乙醇1mL，清洗EP管，吹打混勻，4℃、7500r／min離心5min，棄上清，重復(fù)1次；所得RNA用紫外分光光度法定量，并于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增：50mL反應(yīng)體系中含有2×RT－PCRBuffer25μL，模板RNA×1μL，β－actin、Bc1－2和Bax上下游引物各1μL，RT／TaqMix1μL，其余體積為DEPC水。循環(huán)參數(shù)：β－actin為94℃2min，94℃50s，55℃50s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃5min；Bcl－2為94℃2min，94℃30s，50℃30s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃5min；Bax為94℃2min，94℃30s，59℃45s，72℃45s，30個循環(huán)，72℃5min。以上均采用熱啟動方式，預(yù)變性后，于72℃條件下加入TaqDNA聚合酶。

1.5.5 PCR產(chǎn)物電泳鑒定RT－PCR后的DNA產(chǎn)物加入染料后離心1000r／min×30s，充分振蕩，取10μL于115%瓊脂糖凝膠電泳，100V，1h，E B染色，紫外燈下拍照。

1.5.6 圖像分析用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)測定PCR產(chǎn)物電泳密度，各基因mRNA表達強度以其PCR產(chǎn)物電泳密度值與β－actin的比值來表示。

2 結(jié) 果

實驗結(jié)果 見表1、表2。

表1 5組Bcl－2mRNA表達比較（±s）

表1 5組Bcl－2mRNA表達比較（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與針刺組比較，2）P＜0.05。

55.792±1.356假手術(shù)組 51.021±0.808針 刺 組 54.387±1.2421）電 針 組 53.45±1.1211）2）西 藥 組 53.632±0.7221）2）B c l－2mR NA模型組分 組 大鼠／只

表2 5組B a x mR NA表達比較（±s）

表2 5組B a x mR NA表達比較（±s）

注：與模型組比較，1）P＜0.05；與針刺組比較，2）P＜0.05。

50.912±0.221假手術(shù)組 52.686±0.525針 刺 組 51.720±0.4521）電 針 組 52.222±0.57421）2）西 藥 組 52.131±0.7461）2）B a x mR NA模型組組 別 大鼠／只

3 討 論

研究認(rèn)為B c l－2過度表達可抑制細胞凋亡，從而使細胞增殖和凋亡失去平衡，導(dǎo)致細胞數(shù)量的相對增多。B a x基因是B c l－2基因家族中的一個凋亡促進基因，B a x與B c l－2作用相反，能夠促進凋亡［1］。K y p r i a n o u等［2］發(fā)現(xiàn) B c l－2在前列腺增生組織中表達較前列腺正常組織明顯升高。本實驗結(jié)果表明：模型組前列腺細胞B c l－2高表達，給予治療干預(yù)后，針刺組、電針組、西藥組明顯低于模型組，電針組、西藥組明顯低于針刺組，電針組雖低于西藥組，但無明顯差異；模型組前列腺細胞B a x呈低表達，給予治療干預(yù)后，針刺組、電針組、西藥組明顯高于模型組，電針組、西藥組明顯高于針刺組，電針組雖高于西藥組，但無明顯差異。電針治療B P H的機制是通過降低B c l－2基因表達，提高B a x基因的表達，使B c l－2／B a x比值恢復(fù)到平衡狀態(tài)，通過調(diào)節(jié)凋亡基因的平衡抑制前列腺的增生。

［1］趙建新，田元祥，谷世喆 .電針對腦缺血再灌注損傷小鼠海馬神經(jīng)元凋亡及B c l－2、B a x表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（4）：235－237.

［2］顧方六.現(xiàn)代前列腺病學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：63.