杜彬榮

(浙江省紹興市第二醫(yī)院中藥房，紹興 312000)

藥用人血漿蛋白制備的研究進展

杜彬榮

(浙江省紹興市第二醫(yī)院中藥房，紹興 312000)

人血漿蛋白制品的經(jīng)典制備方法是低溫乙醇法。目前，國際上已成功對最初的低溫乙醇法工藝進行了改良，相關研究方興未艾。該文綜述適應證最廣、所占市場份額最大的四大類8種藥用人血漿蛋白，如清蛋白、人免疫球蛋白、人凝血因子Ⅷ、人凝血因子Ⅸ、人凝血酶原復合物、α1-抗胰蛋白酶、人抗凝血酶Ⅲ、人蛋白C等的制備進展。

血漿蛋白；清蛋白；免疫球蛋白；凝血因子

藥用人血漿蛋白制品是血液制品的一個分支，是從人類血漿中分離制備的具有臨床意義的蛋白制品的總稱。單一蛋白制品具有生物活性效價高、療效可靠、純度高、使用安全、穩(wěn)定性好等特點。目前，已經(jīng)有200多種人血漿蛋白被認定具有獨特的生物功能，但只有20多種人血漿蛋白實現(xiàn)工業(yè)化制備[1]。對人血漿蛋白制品的進一步研究開發(fā)，對其工藝的進一步改進，可使其在現(xiàn)代醫(yī)學中發(fā)揮更加重要的作用。

1 清蛋白制品

清蛋白的分離純化也一直是血液分級制備中的研究熱點。低溫乙醇法(Cohn法)是由美國的Cohn等開發(fā)，它作為分離清蛋白的經(jīng)典方法，具有重要的歷史地位[2]。該方法的原理是依靠乙醇逐級沉淀血漿，將血漿分為若干個沉淀組分，簡稱為Cohn組分，根據(jù)沉淀產生的不同階段將組分編號為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等。經(jīng)過乙醇沉淀，已經(jīng)對各類蛋白進行有效地粗分離，然后進$一步純化各部分沉淀(包括Cohn沉淀Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等)中的蛋白獲得蛋白純品。清蛋白存在于沉淀Ⅴ中，現(xiàn)階段一般采用在Cohn法基礎上發(fā)展起來的Kistler-Nitschmann法[2]對清蛋白進行純化。將層析技術引入到低溫乙醇法中，可以提高清蛋白的回收率和純度，克服單純低溫乙醇法所得蛋白純度不夠高的缺點。國內報道經(jīng)凝膠柱層析和超濾后的清蛋白純度可以達到99.8%，而層析之前的清蛋白純度僅為91.0%[3]。目前，楊曉波等[4]在經(jīng)典的Cohn法中引入萃取技術分級血漿，研究發(fā)現(xiàn)該方法降低了稀釋倍數(shù)，減少了乙醇用量，保持了清蛋白的天然活性，提高其純度。

2 人免疫球蛋白制品

根據(jù)免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)的氨基酸組成和排列不同，可分為人免疫球蛋白M(IgM)、人免疫球蛋白A(IgA)、人免疫球蛋白D(IgD)、人免疫球蛋白E(IgE)、人免疫球蛋白G(IgG)五大類，其中IgG是再次免疫應答的主要抗體，具有重要的免疫效應，在機體抗感染中起了主要作用。

低溫乙醇法是制備IgG的主要方法，目前，絕大多數(shù)廠家都采用這個方法。改變Cohn法中的沉淀Ⅱ和Ⅲ的pH、溫度、離子強度、蛋白濃度等條件，能夠分離得到人免疫球蛋白沉淀物。層析制備人免疫球蛋白能夠大大提高蛋白純度。三步層析法制備人免疫球蛋白，經(jīng)預處理的血漿分別通過DEAE-Sepharcose CL-6B、lysine-Spharose 4B、SP-Spharose 4B三個層析柱，洗脫所得的免疫球蛋白純度接近100%[1]。目前，有學者采用載有 ω-aminodecyl的瓊脂糖層析柱，在中性pH條件下一步純化得到免疫球蛋白，證明這種以離子交換和疏水效應同時起作用的層析柱可以高效純化免疫球蛋白[5]。

3 凝血因子類制品

3.1 人凝血因子Ⅷ 凝血因子Ⅷ也稱為血友病球蛋白，是內源性凝血途徑中的一種重要凝血因子。凝血因子以異二聚體和血管性血友病因子結合形成的復合物形式存在于體內。

鑒于人凝血因子的穩(wěn)定性較差，適宜采用較溫和的純化方法。國外有學者將經(jīng)冷沉淀處理后的血漿，通過DEAE-Fractogel層析得到人凝血因子Ⅷ，這種高效率的離子交換層析技術與S/D病毒滅活處理的相容性較好，已被推廣到工業(yè)化制備人凝血因子Ⅷ[1]。將血管性血友病因子的單克隆抗體耦聯(lián)至層析住上，最后用高濃度的鈣離子洗脫人凝血因子Ⅷ，這種免疫親和層析技術利用特異性親和作用，使得該分離技術在制品純度上具有明顯優(yōu)勢。盡管免疫親和層析制備凝血因子Ⅷ已經(jīng)得到了工業(yè)化應用，但是仍存在親和柱使用壽命不長和親和配基污染的問題。菅長永[6]在制備工藝中引入了DEAE-Sephadex A50凝膠層析柱，可以吸附去除酸沉淀后上清液中的人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ部分纖維蛋白原和大部分纖維結合蛋白。用該工藝代替經(jīng)典的氫氧化鋁[Al(OH)3]吸附法，除有效減少上清液中人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ以及纖維結合蛋白之外，還避免了鋁離子的引入，從而增強人凝血因子Ⅷ制劑的安全性。康麗梅等[7]用超大孔離子交換色譜純化所得人凝血因子Ⅷ的回收率高達85%，加快了分離速率，蛋白比活力達到154 U·mg-1，該純化工藝步驟少，并且易于放大。

3.2 人凝血因子Ⅸ 利用多步層析法，配合超濾、脫鹽、濃縮純化人凝血因子Ⅸ(FⅨ)的方法，所制備的人凝血因子Ⅸ的純度較高；利用親和層析法生產高純度FⅨ的工藝已經(jīng)比較成熟。

3.3 人凝血酶原復合物 該復合物主要含有人凝血因子Ⅸ(FⅨ)、人凝血因子Ⅹ(FⅩ)、人凝血因子Ⅱ(FⅡ)、人凝血因子Ⅷ(FⅧ)。通過無機鹽吸附劑和離子交換層析是純化人凝血酶原復合物的主要手段。由于凝血酶原復合物中4種成分的等電點較低，目前世界上絕大多數(shù)工廠采用DEAE-Sephadex A50層析制備人凝血酶原復合物。將加入了枸櫞酸鹽的血漿和去冷沉淀的血漿作為分離原料，通過調整吸附條件和洗脫條件可以改變人凝血酶原復合物中4種人凝血因子的含量和FⅨ的比活力。熊瑩等[8]對大孔陰離子樹脂分離制備人凝血酶原復合物的條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)分別在人凝血酶原復合物中加入蛋白保護劑蔗糖和甘露醇，可以顯著提高人凝血酶原復合物的活性。LIHME等[9]建立了一種以DEAE-tungsten carbide agarose為介質的擴張吸附床來制備人凝血酶原復合物的工藝，整個工藝過程耗時4.8 h，制備所得的復合物含F(xiàn)Ⅱ、FⅨ和FⅩ，不含有FⅦ。曹海軍等[10]通過正交實驗法優(yōu)化了制備人凝血酶原復合物的工藝條件包括pH、檸檬酸鈉濃度、氯化鈉濃度及電導率，研究發(fā)現(xiàn)對于不同分析方法，結果有一定差異。

4 蛋白酶抑制劑

4.1 α1-抗胰蛋白酶 α1-抗胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，占血漿中抑制蛋白酶活性的90%，在Cohn組分Ⅳ中加入氯化鋅，沉淀后經(jīng)離子交換層析，最后去除病毒完成α1-抗胰蛋白酶抑制劑的制備，目前該工藝已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化。KUMPALUM等[11]利用金屬螯合層析技術有效分離了α1-抗胰蛋白酶和清蛋白這兩種等電點接近的血漿蛋白，然后用交換層析進一步純化，該工藝沒有損失α1-抗胰蛋白酶的活性。莊明強等12]在Cohn組分Ⅳ中加入1，4-二硫蘇糖醇，破壞雜蛋白的穩(wěn)定性，再用二氧化硅吸附去除雜蛋白。富含α1-抗胰蛋白酶的濾液經(jīng)過壓濾、離子交換層析和疏水層析，所制備的α1-抗胰蛋白酶的純度為97.6%，回收率為21%。葉生亮等[13]建立了一種依次經(jīng)過陽離子交換層析和陰離子交換層析的工藝來制備，該工藝制備的α1-抗胰蛋白酶比活性高達0.94 pU·mg-1。

4.2 人抗凝血酶Ⅲ 制備人抗凝血酶Ⅲ的經(jīng)典方法是將Cohn組分Ⅰ的上清液或組分Ⅲ沉淀的溶液通過肝素親和層析柱分離純化，再經(jīng)巴氏消毒、納米膜過濾，最后分裝凍干制得凍干人抗凝血酶Ⅲ制品。楊曉波等[4]將Heparin-Hyper D引入到親和層析中，大大提高了層析容量和流量。穆成華等[14]自制了一種瓊脂糖凝膠6FF，并在此基礎上還原胺化制備了肝素瓊脂糖凝膠6FF介質。用該介質來分離抗凝血酶Ⅲ，研究發(fā)現(xiàn)當肝素配基的含量為2.7 mg·mL-1時，從人血漿中純化所得的抗凝血酶Ⅲ活性回收率為31.76%。

4.3 人蛋白C 人蛋白C的理化性質與其他維生素K依賴性絲氨酸蛋白酶比較接近，這也給人蛋白C的純化帶來了很大的難度。現(xiàn)代純化技術已經(jīng)淘汰了最初的鋇鹽吸附法，取而代之的是逐步層析法，特別是其中的親和層析技術顯著提高了人蛋白C的純度。RADOSEVICH等[15]提出了一種依次通過DEAE-Sephadex A-50、DMAE-Fractogel MED，Heparin-Sepharose CL-6B層析柱，再經(jīng)超濾脫鹽、濃縮，最后濾菌凍干制得凍干人蛋白C的方法。在國內，沈永才等[16]采用相似的技術路線純化蛋白C，所制備的蛋白純度達到90.63%，為實現(xiàn)工業(yè)化制備做了前期的探索。王宗奎等[17]將離子交換層析與金屬螯合親和層析串聯(lián)起來，純化所得的人蛋白C總活性回收率達到(28.77±9.45)%，純化倍數(shù)達(136.64±6.82)，比活性為(11.70±0.89) U·mg-1，表明該工藝可以制備比活性較高的人蛋白C。

5 展望

國際上，已有提出利用線性規(guī)模制備電泳技術來制備血漿蛋白。線性規(guī)模制備電泳技術是一種線性規(guī)?；拿氀苤苽潆娪炯夹g。該技術利用血漿蛋白的電荷和分子大小的差異達到分離純化的目的，它的優(yōu)勢在于分離時間短、產品純度高、蛋白回收率高、蛋白生物活性保持良好。線性規(guī)模電泳技術在制備高純度制劑方面比層析技術有著明顯的優(yōu)勢，但是推廣到工業(yè)化尚缺乏成熟的設備。

親和層析技術與其他層析技術比較，其優(yōu)勢在于特異性地選擇和吸附目標蛋白，所制備的蛋白的純度高。該技術的關鍵是獲得理想配基。仿生親和層析通過兩種技術來獲得理想的配基，其一是噬菌體顯示技術，在短時間內產生大量多肽和小分子，并表達在噬菌體末端。一旦發(fā)現(xiàn)潛在配基，可以通過變異結合位點的氨基酸獲得理想的配基。最后通過基因重組技術合成所需配體。其二是組合化學技術，結合生物物理學、晶體學等技術，用計算機分析蛋白空間結構，再根據(jù)生物物理學和生物化學原理設計合理的理想配基。

目前，我國的血漿綜合利用率不高，藥用血漿蛋白品種較少，與國外的差距較大。隨著人們對血漿蛋白臨床應用的認識不斷深入，越來越多的藥用血漿蛋白正在進步開發(fā)。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.022

2013-07-12

2013-12-04

杜彬榮(1981-)，女，浙江紹興人，藥師，學士，研究方向：生物工程。電話：(0)13385851005，E-mail： zucc_zbj@163.com。

R977.8；R943

A

1004-0781(2015)01-0081-03